肉類食品中豬源性成分檢測方法之探討

王志忠 漆曉華

摘 要：文章介紹了幾種主流豬源性成分的檢測方法，同時對各種方法的基本原理、適用范圍及優缺點進行了探討。希望對相關工作提供參考。

關鍵詞：豬源性；檢測方法；擴增；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

食品安全問題是一個永恒的話題，而清真食品安全也成為各穆斯林民族的關注點，其中肉類食品中豬源性成分的檢測已提到一個重要的地位上來。目前，在動物源性成分的檢測方法中，最主要的是基于蛋白質和基因的兩大類檢測方法，利用DNA的分子生物學方法開發定性、定量檢測食品、飼料中動物源性成分的方法和技術已逐漸成為該領域的研究主流，也成為多數國家檢測方法標準中指定的檢測方法[1]。包括傳統擴增（PCR）法，國家標準[2]就采用該法檢測飼料中的豬源性成分，而實時熒光定量擴增（PCR）法和雙重熒光擴增法是在傳統實時PCR法基礎上發展而來的，具有快速、高靈敏等優點。同時，亦有采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進行檢測的研究，幾種方法各有優缺點。下面，文章對常用的傳統PCR法、實時熒光定量擴增（PCR）法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進行分析探討，供食品檢驗人員借鑒。

1 傳統PCR法

傳統PCR法的基本原理，是對高溫下將雙鏈DNA變成單鏈的模板DNA的兩條鏈的一段互補序列，在適宜溫度下與兩條互不相補的寡核苷酸片段（引物）發生退火，利用DNA聚合酶催化延伸，如此反復擴增。然后利用凝膠電泳染色檢測，與已知陽性、已知陰性及空白組進行對照，如果檢測結果為陽性，再進行內切酶酶切反應，并將反應結果再次進行對照。酶切反應亦為陽性，則判定含有豬源性成分。

傳統PCR方法的靈敏性和特異性較高，目前是鑒別豬源性成分的主要選擇。但在檢測中局限性較大，由于假陽性率高，最終定性需要進行酶切反應造成檢測時間較長，而通過條帶亮度進行定量準確性相對較差，特別是在較大濃度它種動物肉存在下會明顯影響其靈敏度，不適用于摻入豬源性成分的肉類食品的檢測。

2 實時熒光定量擴增（PCR）法

實時熒光定量擴增法是美國Applied Bio systems公司基于傳統PCR法于1996年所提出，原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，其中包括熒光染色和熒光探針兩種辦法（目前以熒光探針技術為主，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性切斷探針，產生熒光信號），利用每次擴增循環的熒光信號積累實時監測整個PCR進程，在整個PCR反應過程中，熒光定量PCR儀對反應體系中熒光信號的變化量進行連續檢測，記錄其增加到某一閾值時所對應的PCR循環次數即循環閾值（Cycle threshold，Ct值），最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[3]。由于在PCR擴增時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在有線性關系，所以可以成為定量的依據。簡單地說，其擴增程序與傳統PCR法基本一致，但采用了在擴增過程中添加熒光劑的手段，并在每次擴增循環后收集熒光做出擴增曲線，根據擴增曲線和Ct值判定其結果。

實時熒光定量擴增法的優點是，縮短了檢測時間，克服了PCR固有的平臺效應，從而可以較為準確進行定量，同時在較大濃度它種動物肉存在下不會明顯影響其靈敏度。但熒光探針法存在只適合特定目標、本底較低的探針難以找到等問題，特別是檢測成本昂貴，難以大范圍應用。

3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法的原理是，在一定條件下提取的不同肉類肌漿蛋白會存在含量和種類差異，利用此差異，篩選出用離子強度為0M的純水提取肉中的肌漿蛋白，經過SDS-PAGE電泳鑒別豬肉特有的條帶，從而區分豬肉和其它肉類。同理，該方法亦可區分鑒別其它肉類。

Orhan等人于2011年[4]利用肌漿蛋白亞基數和分子質量存在差異區別了生活在不同流域的遠東紅點鮭魚；Magdalena[5]、Hugo A[6]等也利用了肌漿蛋白的亞基條帶和分子量的差異對牛、馬、豬、羊等動物物種進行了區分。

該方法的優點是，基于肌漿蛋白的差異性鑒定動物源性成分，較基于DNA序列特異性的PCR法成本較低，對儀器和操作要求也比較低，但在靈敏度、準確度和檢測限等方面不及PCR法，特別是無法對豬源性成分進行定量，應用受到限制。

4 結束語

從上文看出，PCR和實時PCR法是目前豬源性成分檢測的主流方法，其定性準確，并可以對被檢成分進行定量，但對儀器設備要求較高，擴增耗時較長，難以進行快速檢測，同時檢測成本較高，特別是實時PCR法的成本昂貴。SDS-PAGE法檢測成本較低，且耗時較少，適用于現場快速檢測方法的開發，但靈敏度和準確度方面需進一步提高。

最后，需要說明的是，以上方法鑒別豬源性成分僅限于含有生鮮肉的制品，對于加工煮熟的肉制品則難以鑒定，尚需研究更新更好的檢測方法。

參考文獻

[1]李家鵬，喬曉玲，等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展[J].食品科學，2011，32（9）：340-346.

[2]GB/T 21101-2007.動物源性飼料中豬源性成分定性檢測方法[S].PCR方法.

[3]Heid CA，Stevens J，Livak K J，etal.Real time quantitative PCR [J].Genome Research，1996，6：986-994.

[4]Orhan Demir，Ali Günlü，Fahrettin Kücük，et al. Analysis of sarcoplasmic proteins in natural populations of mountain trout with SDS-PAGE[J].African Journal of Biotechnology，2011，10（55）：11758-11763.

[5]Magdalena Montowska，Edward Pospiech. Species identification of meat by electrophoretic methods[J].Acta Sci.Pol.，Technol.Aliment，2007，6（1）：5-16.

[6]Hugo A，Caldironi，Nicolas G. Quantitative determination of low-salt soluble protein patterns of bovine muscles cooked at different temperatures，by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J].Jourmal of Food Science，1980（45）：901-904.