錦雞兒根瘤菌生理生化特性及其對宿主生長的影響

王宇等

摘 要：文章對兩株錦雞兒根瘤菌的生長特點和生理生化特性進行比較研究，通過回接實驗分析兩株根瘤菌對錦雞兒植物生長的影響。結果表明：（1）在YMA培養基上I號菌株生長比II號菌株快；（2）兩菌株細胞表面成分中纖維素含量都較少；（3）兩菌株的耐鹽能力相同，pH值生長范圍一致、但生長的最佳pH值不同；（4）兩菌株對所測碳源利用的有差異，對所測氮源的利用情況較一致；（5）兩菌株都可以促進錦雞兒植株的生長，其中II號菌株對錦雞兒生長的促進作用大于I號菌株。

關鍵詞：錦雞兒；根瘤菌；生理生化；回接實驗

錦雞兒屬（Caragana）植物屬于豆科植物、落葉灌木，是歐-亞草原植物亞區的典型植被。全世界約有100余種，我國的錦雞兒屬植物主要分布在荒漠區和草原[1，2]。錦雞兒屬植物具有耐寒耐瘠薄、防風固沙、保持水土的能力，可提高土壤肥力、改善土壤結構，在荒漠化生態環境中發揮著重要角色。李香真等報道在退化草地恢復過程中，小葉錦雞兒灌叢誘導了植物組成、生物量和土壤化學元素含量在空間上的分異，這種生態效應有利于退化草地的恢復[2-4]。此外，錦雞兒屬植物具有綠肥、燃料、飼料、油脂等資源價值，在食品、醫藥、能源、畜牧業等領域有廣泛的應用前景[5，6]。

根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系是已知固氮能力最強的生物固氮體系之一，所固定的氮量占全球生物固氮總量的65%以上[7]。有許多關于根瘤菌的分類、固氮機理、與宿主相互作用等的報道，但研究主要集中在對大豆、苜蓿、紫云英等草本豆科植物。對錦雞兒、沙冬青、刺槐等喬木、灌木、半灌木豆科植物根瘤菌資源的研究有些不足[8-10]。錦雞兒屬植物是內蒙及西部荒漠化地區生態恢復與重建的先鋒樹種，錦雞兒植物生態功能的發揮與其根瘤固氮作用密切相關。錦雞兒根瘤固氮作用可以促進植株生長和植被恢復，有助于提高群落結構復雜性、生物多樣性，保持和恢復生態平衡[3，11]。文章對從錦雞兒根瘤分離的菌株進行耐鹽、耐酸堿、碳氮源利用等生理生化特性測試，并回接錦雞兒研究其對宿主生長行為的影響，為實施退耕還林還草進行可持續性農業發展提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試根瘤菌I號菌株和II號菌株由內蒙古農業大學農學院病理教研室分離、鑒定和保藏。

1.2 生長曲線的測定

將I、II號菌株接種到YMA培養基（甘露醇10g、酵母提取粉0.8g，K2HPO4 0.2g、KH2PO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml），28℃條件下培養。每天測定細菌的生物量，連續測定7天。

1.3 生理生化特性的測定

1.3.1 剛果紅染色反應

將80？滋gml-1剛果紅加入到YMA固體培養基中，滅菌后倒平板。接種供試菌株，28℃條件下培養5天，觀察菌落顏色。

1.3.2 耐鹽性測試

將NaCl加入到YMA培養基中配成濃度為1%、2%、3%、4%、5%和6%等梯度，以不加NaCl的YMA平板培養基為對照，滅菌后倒平板。接種供試菌株，28℃條件下培養7天后稱量生物量，每個處理3個重復。

1.3.3 耐酸堿性測試

用HCl和NaOH將YMA培養基調節pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0等梯度。培養測量同上。

1.3.4 單一碳源的利用

選用YMA培養基進行測試，利用的碳源分別是：甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，每種碳源加10g/1000ml。培養測量同上。

1.3.5 單一氮源的利用

選用YMA培養基進行測試，利用的氮源分別是：酵母提取粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、KNO3、NaNO3，每種氮源加0.8g/1000ml，不加氮源為對照。培養測量同上。

1.4 回接實驗

錦雞兒種子用75%的酒精處理15min，用30%的H2O2進行表面消毒5min后，無菌水沖洗。經過消毒的種子置于培養皿中催芽2天，將發芽的種子栽于花盆中（土壤與蛭石1：1混合）。出苗生長4周后接種I號、II號菌株，每盆接種10ml供試菌株YMA液體培養物，對照接種10mlYMA液體培養基，每個處理22個的重復，生長9周后收獲。

1.5 數據處理

利用EXCEL軟件進行數據歸納總結，并根據計算的出的平均生物量構建圖表；并用SPSS統計分析軟件進行單因子方差分析。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌的菌落形態和生長特征

供試根瘤菌I號和II號菌株的菌落形態見圖1。圖1I是I號菌株28℃條件下培養3天的菌落形態，圖1II是II號菌株28℃條件下培養5天的菌落形態，說明I號菌株的生長快于II號菌株。I、II號菌株的生長曲線如圖2。I號菌株第1、2和3天生長緩慢，為延遲期生長；第4和5天生長較快，為對數期生長；第6和7天生長緩慢，為衰退期生長。II號菌株第1、2、3和4天生長緩慢，為延遲期生長；第5天生長較快，為對數期生長；第6和7天生長緩慢，為衰退期生長。到第7天時，I和II號菌株平均生物量的相差0.11g，表明I號菌株的生長明顯地比II號菌株快。

2.2 生理生化特性

剛果紅染色反應顯示I號和II號菌株菌落呈淺桔黃色，都不吸收剛果紅染料，表明細胞表面成分中纖維素含量較少。

由耐鹽性測試可知（表1），在對照不加NaCl的條件下，I、II號菌株長勢良好；I、II號菌株均可在1%[Na+]的條件下可以生長，但它們的生物量顯著低于對照；在2%-6%[Na ]條件下，I、II號菌株均不能生長，表明I、II號菌株的耐鹽能力相同。

耐酸堿性測試結果為I、II號菌株在pH值為6.0、7.0、8.0、9.0條件下均能生長，在pH值為3.0、4.0、5.0、10.0、11.0、12.0條件下不能生長（表1）。從結果分析可知：I號菌株在PH=8.0時生長的最好，II號菌株在PH=7.0時生長的最好；I號菌株比II號菌株耐堿的能力稍強一些。

不同碳源利用測試中I菌株生物量大小的排列順序為：甘露醇>蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉>麥芽糖>乳糖，II號菌株生物量大小的排列順序為：蔗糖>甘露醇>葡萄糖>乳糖>可溶性淀粉>麥芽糖（表1）。I、II號菌株都能較好地利用甘露醇和蔗糖，不能很好地利用乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉。I號菌株在葡萄糖的培養基上生長的不好，而II號菌株在葡萄糖的培養基上生長的很好，I、II號菌株對葡萄糖的利用差異較大。研究結果表明I、II號菌株對所測碳源利用的有差異。

對本實驗所測試的氮源分為無機態氮和有機態氮兩類，實驗結果表明I、II號菌株對所測氮源的利用情況較一致。兩菌株對有機氮的利用都比無機氮好，其中對酵母提取粉的利用極其顯著地比其它有機氮好；其次是酵母膏；蛋白胨、牛肉膏、尿素的利用雖然比酵母提取粉和酵母膏差，但也比對無機氮的利用好（表1）。YMA培養基成分中去掉酵母提取粉為無氮素對照，I、II號菌株在無氮培養基上的生長比在無機氮的處理顯著地好。

方差分析表明在0.01水平上，[Na+]、pH值、碳源和氮源對I和II號菌株的生長都具有顯著的影響（表1）。

2.3 對錦雞兒生長的影響

接種I號菌株的22株錦雞兒中有19株根系形成根瘤，根瘤米黃色、橢球狀、大小為1-2.5mm、單株植物的平均結瘤數為4.2個；接種II號菌株的22株中有20株的根系形成根瘤，根瘤米黃色、球狀、大小為0.5-1mm、單株植物的平均結瘤數為6.7個。從圖3可看出，接種I號和II號菌株植株的根系細、長、顏色淺，在花盆土壤中分散分布且深扎到花盆土壤底部；對照植株的根系成簇生長且較短、顏色深，沒有根瘤形成。

經過測試從表2可知，接種I號菌株、接種II號菌株和對照植株CK的平均株高和地上部分平均生物量從大到小的順序均為：II>I>CK。從方差分析結果可知，接種I號菌株、II號菌株植株的平均株高和地上部分平均生物量都顯著地大于對照植株，接種II號菌株植株的平均株高和地上部分平均生物量又顯著地大于接種I號菌株的植株。接種I號菌株、接種II號菌株和對照植株根系的平均長度和地下部分平均生物量從大到小的順序也是：II>I>CK（表2）。從方差分析結果可知，接種I、II號菌株植株的根系的平均長度與地下部分平均生物量顯著地大于對照植株；接種II號菌株植株的根系平均長度大于接種I號菌株植物的根系平均長度，但差異不顯著；接種II號菌株植物的地下部分平均生物量顯著地大于接種I號菌株的植物。實驗結果證明根瘤菌I、II號菌株是具有結瘤能力并且可以促進的錦雞兒植株的生長，其中II號菌株對錦雞兒生長的促進作用大于I號菌株。

3 討論

土壤的溫度、含水量、鹽堿性、酸堿度、有機質含量等因素直接影響根瘤菌的生存、生長、結瘤和固氮能力[12-17]。Hashem等研究表明土壤鹽離子濃度影響根瘤菌的生存和增殖，影響根瘤共生系統的固氮效率[14]。Herrera等研究認為根瘤菌的抗逆性是豆科植物與根瘤菌能否形成有效根瘤的限制因素，也是檢測根瘤菌生態適應范圍和固氮能力的一項重要指標[15]。不同種屬的根瘤菌對溫度、酸堿度、鹽堿等脅迫有不同的耐性，同種屬不同地區根瘤菌分離株對逆境的忍耐力也有所差異，這可能是由于根瘤菌與相應的宿主植物長期對生存環境適應的結果。本研究從鄂爾多斯地區錦雞兒分離的兩株根瘤菌只能忍耐1%NaCl、pH值生長范圍在6.0-9.0之間；王衛衛等分離新疆錦雞兒屬植物的兩株根瘤菌菌株可忍耐NaCl的濃度分別為2%和3%，可在pH值為4.0-5.0和10.0的條件下生長[16]，可以看出新疆錦根瘤菌比鄂爾多斯根瘤菌抗逆性更強些。可能是由于新疆地區基本上屬于干旱荒漠土壤、又嚴重的鹽堿化，高溫、干旱、鹽堿和溫度變化劇烈為新疆干旱地區生態條件的顯著特征，這些生態環境中逆性因素對當地根瘤菌長期的自然選擇，使得根瘤菌可適應在該地區嚴重鹽堿化荒漠土壤中生存，關桂紅等報道從新疆地區其他豆科植物根瘤分離的根瘤菌多數具有較強的耐鹽性、耐酸堿、耐高溫等抗逆能力[17]。

本研究結果證明，接種I號、II號菌株植株的根系較對照植株長、在土壤中分布范圍更大，這樣有利于吸收更多的營養物質，從而有利于錦雞兒植株的生長。兩個供試菌株之間相比較，它們對錦雞兒生長的影響作用有差異。如I號菌株與錦雞兒根系形成的根瘤比II號菌株形成的根瘤大；接種II號菌株植物的平均單株結瘤數比接種I號菌株的多；接種II號菌株植株的株高、根系長度、生物量大于接種I號菌株的植株。用分子生物學鑒定結果是：I號菌株屬于根瘤菌屬（Rhizbobium）、II號菌株屬于中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）（未發表），這說明不同種屬的根瘤菌對錦雞兒植物生長的促進作用不同。關于接種根瘤菌對苜蓿、大豆、花生等草本豆科植物的研究和應用很多，對木本豆科植物這方面的研究相對較少[18-21]。下一步我們將分析接種不同根瘤菌菌株對錦雞兒植株的蛋白質、葉綠素、纖維素等含量的影響，綜合評價接種不同根瘤菌菌株對錦雞兒植物生長的促進作用，為錦雞兒根瘤菌菌劑的研發和實施提供理論依據。

參考文獻

[1]牛西午.中國錦雞兒屬植物資源研究-分布及分種描述[J].西北植物學報，1999，19（5）：107-133.

[2]周道瑋，劉鐘齡，馬毓泉.豆科錦雞兒屬（CaraganaFabr.）植物地理分布與分化研究[J].植物研究，2005，25（4）：471-487.

[3]張媛媛，馬成倉，韓磊，等.內蒙古高原荒漠區四種錦雞兒屬植物灌叢沙包形態和固沙能力比較[J].生態學報，2012，11：3343-3351.

[4]李香真，張淑敏，邢雪榮.小葉錦雞兒灌叢引起的植物生物量和土壤化學元素含量的空間變異[J].草業學報，2002，1（7）：24-30.

[5]賈麗，曲式曾.豆科錦雞兒屬植物研究進展[J].植物研究，2001，21（4）：515-518.

[6]潘蘭，賈新岳，石明輝，等.新疆產四種錦雞兒的民族植物學調查[J].中國現代中藥，2013，15（7）：578-579.

[7]陳文峰，陳文新.我國豆科植物根瘤菌資源多樣性及應用基礎研究[J].生物學通報，2003，38（7）：1-4.

[8]史曉霞，師尚禮，楊晶，等.豆科植物根瘤菌分類研究進展[J].草原與草坪，2006，1（114）：12-17.

[9]李喬仙，張斌，戴燕燕，等.南苜蓿根瘤菌生理生化特性研究.安徽農業科學，2009，37（22）：10365-10369.

[10]趙葉舟，王浩銘，汪自強.豆科植物和根瘤菌在生態環境中的地位和作用[J].農業環境與發展，2013，30（4）：7-12.

[11]張紅娟，張朝陽，強磊.檸條錦雞兒根瘤菌及其共生固氮基因多樣性[J].西北植物學報，2014，23（10）：194-199.

[12]KucukC，KivanM，KnaciE.CharacterizationofRhizobiumsp.isolatedfrombean[J].TurkJbio，L2006，30：127-132.

[13]陳文新.土壤中影響根瘤菌存活的主要因素[J].土壤學進展，1986，5：179-184.

[14]HashemFM，SwelimDM，KuykendallLD.Identificationandcharacterizationofsaltandthermo-tolerantLeucaenanodulatingRhizobiumstrains[J].BiolfertilSoils，1998，27：335-341.

[15]HerreraMA，SalamancaCP，BareaJ.InoculationofwoodylegumeswithselectedarbuscularmycorrhizalfungiandrhizobiatorecocerdeseritifiedMediterraneanecosystems[J].ApplEnvironMicrobio，1993，56（1）：129-133.

[16]王衛衛，關桂蘭，李仲元.新疆根瘤菌抗逆性研究[J].干旱區研究，1989，4：9-18.

[17]關桂蘭，郭沛新，王衛衛，等.新疆干旱地區根瘤菌資源研究Ⅱ.根瘤菌抗逆性及生理生化反應特性[J].微生物學報，1992，05：346-352.

[18]周利平，劉文杰，馬煥成，等.根瘤菌菌株和接種根瘤菌植株的耐旱性研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（22）：11978-11980+11983.

[19]劉曉云，郭振國，楊亞男，等.地木耳提取液及根瘤菌對小葉錦雞兒幼苗生長的影響[J].草業科學，2011，28（4）：572-576.

[20]石茂玲，鄧波，劉忠寬，等.5株根瘤菌接種紫花苜蓿的效果[J].草業科學，2015，32（1）：101-106.

[21]鐘增濤，沈其榮，冉煒，等.旱作水稻與花生混作體系中接種根瘤菌對植株生長的促進作用[J].中國農業科學，2002，35（3）：303-308.

作者簡介：王宇（1989-），男，遼寧省鞍山市人，碩士研究生，主要從事土壤微生物方面的研究。