青蛤Cyclina sinensis）IRAK—4基因的克隆及其組織間的表達(dá)分析

楊瑩 高珊 潘寶平 鄭津輝 高虹

摘要 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了青蛤（Cyclina sinensis）白介素-1受體相關(guān)激酶-4（Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）基因的序列信息，利用巢式及熒光定量PCR克隆并分析了CsIRAK-4基因在青蛤各組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步在鰻弧菌的脅迫下檢測(cè)了CsIRAK-4基因在青蛤血淋巴中的時(shí)序表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因的序列全長(zhǎng)共2 687 bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 926 bp，共編碼641個(gè)氨基酸，CsIRAK-4基因在青蛤的血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓中均表達(dá)，其中在血淋巴中表達(dá)量最高，肝臟中表達(dá)量最低。青蛤在鰻弧菌脅迫下該基因的表達(dá)量在3 h即達(dá)到最大值，與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01），證明該基因所表達(dá)的產(chǎn)物是青蛤重要的免疫信號(hào)通路蛋白。

關(guān)鍵詞 青蛤；轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)；熒光定量PCR；CsIRAK-4

中圖分類號(hào) S917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-033-04

青蛤（Cyclina sinensis）是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，棲息于富于泥沙、泥漿的沿海潮汐地帶，廣泛分布于東海、黃海、南海等地[1]。青蛤的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，肉質(zhì)鮮美，且其生長(zhǎng)周期短，耐鹽性好，存活率高，在離水后可較長(zhǎng)時(shí)間生存[2-3]，對(duì)于不良生存環(huán)境有較好的抵御能力[4-5]。近年來(lái)，青蛤增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致青蛤的病害連年發(fā)生，使該項(xiàng)產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重威脅[6-8]。因此對(duì)于青蛤免疫抗病害研究具有重要的實(shí)踐意義。

貝類屬于非特異性免疫系統(tǒng)，其中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是非特異性免疫反應(yīng)中一類重要的識(shí)別受體，在對(duì)抗病原物的侵染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[9-14]。白介素-1受體相關(guān)激酶（Interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAKs）是TLRs信號(hào)通路中的重要成員之一[9，15]。其中白介素-1受體相關(guān)激酶-4（Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）是IRAKs家族中最后發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員[16-17]。IRAK-4基因與IRAKs家族中其他基因結(jié)構(gòu)相似，但缺少一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域，且行使功能時(shí)需要利用其自身激酶的活性[18-19]。研究表明，IRAK-4基因與細(xì)胞免疫過(guò)程中T細(xì)胞受體的識(shí)別過(guò)程密切相關(guān)[20]，這表明，先天免疫系統(tǒng)與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系，而IRAK-4基因在兩者之間起著媒介作用。由此可見(jiàn)，IRAK-4基因在機(jī)體的免疫過(guò)程中至關(guān)重要。

目前，IRAK-4基因在脊椎動(dòng)物中的相關(guān)研究較多，而在無(wú)脊椎動(dòng)物中研究極少，僅在長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）和雜色鮑（Haliotis diversicolor）中有相關(guān)報(bào)道。在與青蛤同源性最高的雜色鮑中，IRAK-4基因在各個(gè)組織中均表達(dá)[9]。目前并未發(fā)現(xiàn)IRAK-4基因在青蛤中的相關(guān)研究，該研究在提高青蛤免疫能力及探索其抗病害機(jī)理方面具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤樣品采集于天津大港灘涂，暫養(yǎng)于人工通氣海水中，海水密度1.02～1.04 g/cm3，水溫21～24 ℃，pH 7.0，投喂5‰小球藻。飼養(yǎng)7 d后，選取表面無(wú)破損，形態(tài)上無(wú)顯著差異的個(gè)體[平均殼寬（19.12±0.57）mm，平均殼長(zhǎng)（29.14±1.23）mm，平均殼高（29.52±1.47）mm）]進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理。

將鰻弧菌（Vibrio anguillarum）菌種在2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，后用無(wú)菌海水離心洗脫3次，重懸菌液，將濃度調(diào)為OD600=0.4。隨機(jī)分組，每次試驗(yàn)設(shè)置10個(gè)平行組。將鰻弧菌菌液注入至試驗(yàn)組青蛤體內(nèi)，50 μl/只，對(duì)照組注射等量的滅菌海水。在注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、鰓、閉殼肌和性腺，分別在注射后3、6、12、24、48、96 h提取血淋巴。準(zhǔn)確稱取各組織50 mg，后放入液氮中冷凍備用。

1.2.2 青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建。

利用TRIZOL提取青蛤各個(gè)組織的總RNA，用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒分離mRNA。采用第二代MiSeq測(cè)序儀，pair end 雙端模式完成青蛤轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用De novo RNA-seq analysis技術(shù)，綜合分析相關(guān)基因功能注釋和代謝途徑，后通過(guò)篩選得到CsIRAK-4基因的類似序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析。

利用獲得的CsIRAK-4基因類似序列設(shè)計(jì)克隆引物CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′，并進(jìn)行克隆，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX比對(duì)，利用開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）在線分析軟件分析其開(kāi)放閱讀框，使用Sig-nalP 3.0分析該基因的信號(hào)肽序列，利用SMART查找其結(jié)構(gòu)域，ProtParam工具在線預(yù)測(cè)此序列的分子量、分子式和等電點(diǎn)，使用Clustal W對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多重比對(duì)。

1.2.4 IRAK-4基因在青蛤各組織內(nèi)的表達(dá)。

利用TRIZOL法提取青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以?actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量引物分別為βactin-S：5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′，βactin-A：5′-C-CGATAGTGATGACCTGACC-3′；CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′；反應(yīng)在 Rotor-Gene 6000實(shí)時(shí)定量 PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增體系為 20 μl，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性表達(dá)。

利用TRIZOL法提取鰻弧菌侵染后各時(shí)間點(diǎn)血淋巴的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應(yīng)體系及程序等參照“1.2.4”。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蛤IRAK-4基因的結(jié)構(gòu)

CsIRAK-4基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 926 bp，共編碼641個(gè)氨基酸（圖1）；其共有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：DEATH結(jié)構(gòu)域（35～129）和S_Tkc結(jié)構(gòu)域（380～638）；其理論分子量為72 552.8，等電點(diǎn)為5.89，分子式為C3206H5069N879O1005S17，氨基酸組成中亮氨酸（Leu）最高，占9.2%。此基因在GenBank的注冊(cè)號(hào)為KR732936。

2.2 青蛤IRAK-4基因的分子系統(tǒng)學(xué)分析

將CsIRAK-4基因與NCBI上已有的其他物種的IRAK-4基因進(jìn)行同源性比對(duì)，使用MEGA4.1軟件構(gòu)建CsIRAK-4基因的系統(tǒng)樹(shù)（圖2），利用bootstrap1000個(gè)循環(huán)檢驗(yàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的置信度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜色鮑（Haliotis diversicolor）、紅鮑螺（Haliotis rufescens）、霸王蓮花青螺（Lottia gigantea）、夏威夷短尾魷魚（Euprymna scolopes）與CsIRAK-4基因在同一分支，此基因與紅鮑螺（Haliotis rufescens）IRAK-4基因的同源性最高，達(dá)57%。

2.3 青蛤IRAK-4基因在不同組織間的表達(dá)

以β-actin基因在各組織中的表達(dá)量為內(nèi)參對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CsIRAK-4基因在其血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓6個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CsIRAK-4基因在此6個(gè)組織中普遍表達(dá)（圖3），但表達(dá)量明顯不同，在血淋巴中表達(dá)量最高，與其他組織相比差異極顯著（P<0.01），閉殼肌次之，肝臟中表達(dá)量最低。表明CsIRAK-4基因主要在血淋巴中表達(dá)。

2.4 在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴中的時(shí)序性表達(dá)

以鰻弧菌侵染青蛤β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)CsIRAK-4基因在血淋巴中表達(dá)的時(shí)序性變化進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組在刺激后3 h的表達(dá)量達(dá)到最大值，明顯高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的17倍，并與對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01）；3 h后表達(dá)量開(kāi)始下降。

3 討論

該研究通過(guò)構(gòu)建青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法獲得了CsIRAK-4基因的類似序列，利用此序列設(shè)計(jì)引物并克隆，后進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因在進(jìn)化中比較保守，與許多水生動(dòng)物的IRAK-4基因具有明顯的相似性。通過(guò)SMART分析其蛋白序列，發(fā)現(xiàn)CsIRAK-4基因共有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain）和激酶結(jié)構(gòu)域（S_TKc Domain），死亡結(jié)構(gòu)域位于第35～129個(gè)氨基酸之間，激酶結(jié)構(gòu)域位于第380～638個(gè)氨基酸之間。死亡結(jié)構(gòu)域作為一種中介將死亡受體和胞漿信號(hào)相連通，在控制機(jī)體的凋亡過(guò)程中有重要作用。在IRAK基因家族中，只有IRAK-1基因、IRAK-4基因具有包含激酶結(jié)構(gòu)域的功能催化位點(diǎn)[21]，但只有IRAK-4基因在下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中使用其激酶活性。同時(shí)，IRAK-4基因還具有一個(gè)高度保守的賴氨酸殘基，此殘基位于ATP結(jié)合位點(diǎn)，在ATP的水解過(guò)程中起關(guān)鍵作用[17，22]。IRAKs在TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的媒介作用[20，23]，因此在先天免疫過(guò)程中IRAKs極為關(guān)鍵。

該研究結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因在各個(gè)組織普遍表達(dá)，在血淋巴中表達(dá)量最高，閉殼肌次之，后依次為鰓、外套膜、性腺，在肝臟中表達(dá)量最低。貝類所具有的非特異性免疫體系中，血液的吞噬作用往往是抗病害的第一道防線，青蛤血液中含有大量的吞噬細(xì)胞、抗菌性物質(zhì)及酶原物質(zhì)，在病原物侵染過(guò)程中其免疫作用非常關(guān)鍵。血細(xì)胞中的CsIRAK-4基因上調(diào)最為明顯，說(shuō)明血淋巴作為軟體動(dòng)物的非特異性免疫防御的首要組織擔(dān)當(dāng)著機(jī)體非特異性免疫防御的重任。而鰓和外套膜在軟體動(dòng)物生存過(guò)程中最先接觸外界環(huán)境，是軟體動(dòng)物抵御外界傷害的第一道防線，因此在其非特異性免疫過(guò)程中也極其重要。

CsIRAK-4所表達(dá)的產(chǎn)物是TLRs信號(hào)通路中重要的信號(hào)蛋白之一，當(dāng)青蛤受到鰻弧菌脅迫后，其血淋巴中該基因在3 h即表達(dá)至最大值，說(shuō)明病原物對(duì)TLRs免疫受體及下游 CsIRAK-4信號(hào)通路蛋白具有強(qiáng)烈的識(shí)別與誘導(dǎo)作用，可使其血液中快速合成相應(yīng)的免疫信號(hào)蛋白，對(duì)抗外來(lái)脅迫物對(duì)機(jī)體自身的侵害。并且CsIRAK-4基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，證明CsIRAK-4基因參與了非特異免疫的全部過(guò)程。該試驗(yàn)結(jié)果為今后貝類增養(yǎng)殖中的病害防治提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] YOON J M.Geographic variations and genetic distance of three geographic cyclina clam（Cyclina sinensis Gmelin）populations from the Yellow Sea[J].Development and reproduction，2012，16（4）：315-320.

[2] 王慧珍.浙江動(dòng)物志：軟體動(dòng)物[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1991：243-256.

[3] LIU W，MA Y，HU S，et al.Rearing Venus clam seeds Cycline sinensis on a commercial scale[J]. Acquaculture，2002，211（1）：109-114.

[4] WANG H Z.Zhejiang fauna[M].Molluscs articles，1991.

[5] WANG R C，WANG Z P，ZHANG J Z.Shellfish aquaculture science[M].Qingdao：Qingdao Ocean University Press，1993：208-209.

[6] 任毅鵬，高晶，潘寶平，等.青蛤（Cyclina sinensis）TLR2 基因的克隆與表達(dá)分析[J].海洋與湖沼，2014，45（5）：1037-1043.

[7] 孫國(guó)銘，萬(wàn)夕和，劉培庭，等.通州海區(qū)灘涂青蛤死亡原因的初步分析[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2004，25（2）：26-27.

[8] 曹華.沿海灘涂青蛤死亡原因初探及對(duì)策[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2004（4）：47-48.

[9] GE H，WANG G D，ZHANG L L，et al.Molecular cloning and expression of interleukin-1 receptor-associated kinase 4，an important mediator of Toll-like receptor signal pathway，from small abalone Haliotis diversicolor[J].Fish & shellfish immunology，2011，30（4/5）：1138-1146.

[10] MEDZHITOV R，PRESTON-HURLBURT P，JANEWAY JR C A.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J].Nature，1997，388（6640）：394-397.

[11] ZHANG D，ZHANG G，HAYDEN M S，et al.A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria[J].Science，2004，303（5663）：1522-1526.

[12] TAKEUCHI O，KAWAI T，SANJO H，et al.TLR6：A novel member of an expanding toll-like receptor family[J].Gene，1999，231（1/2）：59-65.

[13] CHUANG T H，ULEVITCH R J.Cloning and characterization of a sub-family of human toll-like receptors：hTLR7，hTLR8 and hTLR9[J].Eur Cytokine Netw，2000，11（3）：372-378.

[14] HEMMI H，TAKEUCHI O，KAWAI T，et al.A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA[J].Nature，2000，408（6813）：740-745.

[15] JANSSENS S，BEYAERT R.Functional diversity and regulation of different inter-leukin-1 receptor-associated kinase（IRAK）family members[J].Mol Cell，2003，11：293-302.

[16] GOTTIPATI S，RAO N，F(xiàn)UNG-LEUNG W.IRAK1：A critical signaling mediator of innate immunity[J].Cell Signal，2008，20（2）：269-276

[17] LI S，STRELOW A，F(xiàn)ONTANA E，et al.IRAK-4：a novel member of the IRAK family with the properties of an IRAK-kinase[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（8）：5567-5572.

[18] EDWARDS D，TOWB P，WASSERMAN S.An activity-dependent network of inter-actions links the Rel protein Dorsal with its cytoplasmic regulators[J].Development，1997，124：38-55.

[19] TOWB P，BERGMANN A，WASSERMAN S.The protein kinase Pelle mediates feed-back regulation in the Drosophila Toll signaling pathway[J].Development，2001，128（23）：4729-4736.

[20] SUZUKI N，SUZUKI S，MILLAR D，et al.A critical role for the innate immune signaling molecule IRAK-4 in T cell activation[J].Science，2006，311（5769）：1927-1932.

[21] WIENS M，KORZHEV M，PEROVI -OTTSTADT S，et al.Toll-like receptors are part of the innate immune defense system of sponges（Demospongiae：Porifera）[J].Mol Biol Evol，2007，24（3）：792-804.

[22] ZHENG J，KNIGHTON D，TEN EYCK L，et al.Crystal structure of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase com- plexed with magnesium-ATP and peptide inhibitor[J]. Biochemistry，1993，32（9）：2154-2161.

[23] LASKER M，GAJJAR M，NAIR S.Cutting edge：Molecular structure of the IL-1R-associated kinase-4 death domain and its implications for TLR signaling[J].J Immunol，2005，175（7）：4175-4179.