我的碩士生發了篇博士水平的論文

馬中良

2015年諾貝獎獲得者屠呦呦先生，做的是關于中草藥青蒿中提取青蒿素的研究。這不禁讓我想起自己帶的一名研究生張冰潔同學，三年前她開始了中藥組份丹參酮的研究，而丹參酮是從丹參根部提取的有效組分。這個課題并不簡單，也注定了是一條艱辛的道路，因此對于這個從上海大學本科保送的學生來說，我的夢想是她能夠做出一些成績，最低要求是能發表一篇SCI文章，這在當時已經相當不錯了。

選了個難得課題

2012年，剛剛入學的張冰潔同學主動要求開始課題。此時我們課題組的李艷利老師剛從哈佛大學醫學院回來不久，她曾參與過丹參酮在腫瘤中作用的相關課題，研究認為丹參酮可以通過抑制一種癌基因的表達水平，從而抑制胰腺癌。而當時，我們課題組主攻目標是微小RNA（microRNA）在肺癌中的作用，而且這個藥物能否抑制肺癌也是未知。也因此，我給她確定的課題是：丹參酮-microRNA-腫瘤之間的關系。這個課題無論從基礎理論還是將來的應用來看，都有相當的意義，但困難也可想而知。而我們之所以選擇這樣一個課題，是認為這個題目將來的理論及應用潛力巨大：研究肺癌如何發生的；開發治療肺癌的相關藥物，并找到一些藥物的標靶分子。

得到了這個課題后，張冰潔躍躍欲試又憂心忡忡。躍躍欲試是因為她在本科實習的時候接觸過腫瘤及細胞生物學的實驗，如果能夠做好這個課題，將來對科學研究可能興趣大增；憂心忡忡則是因為課題難度太大，她擔心三年時間做不完，因為這個題目之前課題組中沒有人開展過，是一項開創性的工作。

迎戰各種攔路虎

對于一名一年級的研究生同學來說，要想獨立開展一項課題非常不容易。為了做好課題，張同學首先查閱了大量的相關文獻，在最短時間掌握了相關實驗技能，比如課題涉及到的分子生物學技術：蛋白檢測技術（wester blotting）、RNA提取及檢測、實時定量PCR技術以及生物信息學預測技術等等。

在真正展開研究之前，需要對課題進行調研并做可行性驗證。在這個過程中，張同學遇到了很多問題。比如丹參酮處理了腫瘤細胞以后到底哪些microRNA發生了改變（表達量上升或下降）？這個問題如果放在現在，當然非常簡單，只要送到公司，花錢做個細胞測序就好了。但在當時我們是想做探索，不可能也沒有那么多錢做這個工作。所以，張同學又閱讀了大量的文獻，在一些公開發表的數據庫資料的基礎上做相關分析。與此同時，我也檢索了一些文獻。最終我們確定了一些癌基因功能，以及抑癌基因功能的microRNA進行實驗驗證，比如當時已經公認的p53基因，miR-34和let-7等。

除了自己埋頭苦干，在涉及到肺癌方面的具體實驗時，張同學還不忘向專家同行請教。比如做腫瘤模型小鼠的數據分析、microRNA在肺癌中的可能調控途徑分析時，我帶著她請教了上海生科院生化細胞所季宏斌研究員，季宏斌研究員也認為中藥單體的研究是非常有前途的，這個課題非常有意義，這也給了我們很大的鼓勵。在這個過程中，我們還得到了課題組組長、原生化與分子生物學國家重點實驗主任金由辛教授的肯定。得到專家學者們的積極反饋，也讓我們堅信這個課題是有美好的前景的。雖很辛苦，但值得一試。

一波三折的實驗進展

2013年4月到2014年7月，我去美國（MD Anderson Cancer Center）做高級訪問學者。那時張同學已經進入研究生二年級下半年，時間已經很緊迫了，而課題進展卻遇到了瓶頸，有些實驗重復多次也得不到理想的結果。

身在異國，我采取的方法并且可能是唯一可行的方法就是，定期進行視頻交流，根據情況制定后續的任務。當時的一個主要難點是確定藥物處理后有哪些microRNA發生了變化，從而確認抑制癌癥功能的microRNA。而張同學匯報的結果是：所有檢測的microRNA表達水平都是上升的。對于這個結果，我認為是不可能的。因為在一個網絡調控系統中，不可能所有因素都上調。于是，我確定了兩個方案：一是檢查實驗主要是實時定量PCR的步驟是否有誤，做重復實驗，每次改變一個影響因素，再進行檢測；二是重新用藥物處理，從收集細胞到RNA提取、檢查每一步，進行詳細分析，查找原因。

這樣經過一個月的不斷交流、實驗，張同學終于發現問題可能的所在：實驗中對實驗技術的要求很高，尤其是對實時定量PCR的樣品要求很高，一不小心就容易出錯。在我的關注下，張同學的實驗不斷有了的進展，最終發現丹參酮處理后miR-32有了明顯改變。半年以后，我們做了個總結，基本上確定了可以以miR-32為研究目標，以闡明丹參酮處理腫瘤細胞時miR-32表達上升，而由于miR-32可以發揮抑癌基因的功能，最終抑制腫瘤細胞的增殖。

進入研究生三年級之后，張同學的時間越來越緊張了，不過，我們的課題也進入了快車道，實驗得心應手，一般每周都能有很好的進展。這些都歸功于在長期的研究過程中，她閱讀科學文獻能力和理解能力的突出，不僅有大量的科學文獻做基礎，還會積極主動跟進最新課題進展，包括國際上最新的相關文獻，同時能將看到的有用的實驗技術或者思路運用到自己的課題中。因此，她對研究內容的領悟很快，有時還能提出讓我吃驚的看法。比如，她說microRNA-25家族和Let-7家族（另一個著名的microRNA家族，主要是抑癌基因功能）應該有相互協調或相互反饋調控作用，并在實驗中主動加入這些抑制腫瘤的microRNA進行研究。其實我也注意到了這個現象，但是不敢和她提起來。因為這個工作應該是一個博士生的工作，或者兩個碩士研究生接力去研究的內容。

精益求精改稿件

課題進展得比較順利之后，張同學開始在我的指導下撰寫英文文章。每過一段時間我們還會根據實驗最近進展修改，增補文章，這段時間持續了大約半年多。2014年11月，我們的研究得到了課題組李艷利老師，金由辛教授大力支持和幫助。在2014年11月中旬，我們將稿件投稿到英文期刊Oncotarget（腫瘤標靶）。這本期刊在當時的影響因子（IF）為6.67， 也就是說如果能在該期刊發表文章，基本達到了一個博士生畢業的要求。

2015年1月，我們得到了編輯部的反饋。針對審稿人的意見，我們又一起進行實驗的補充，修改意見的答復。比如審稿人要求證明丹參酮是否影響miR-32的轉錄因子調控？這其實這是個連鎖問題：我們得先確定哪個轉錄因子，才能確定丹參酮對轉錄因子是有作用的。而且，這個作用與之前的實驗結果必須要吻合。

于是，我和張同學一起分析這些問題。張同學說，她曾經在一篇文章中看到有介紹雄性激素（AR）作為轉錄因子的內容，我們可以試試AR，另外再確定另一個轉錄因子做備選。在接下來半個月時間內，她做出了實驗結果，該結果也著實讓人非常激動，它完全了符合我們的預期：丹參酮抑制了AR，這樣一來miR-32表達水平上升，最后起到了抑制肺癌的作用。最后我們提出如下機理圖， 這也是國際上首次從microRNA角度闡明中藥組份丹參酮抑制腫瘤機理：

（Oncotarget，2015 Aug 21；6（24）：20111-20，DOI：10.18632/oncotarget.3933）

即丹參酮（Tanshinone）給藥處理后，引起miR-32上升，miR-32抑制癌基因AURKA（圖中）；初步驗證丹參酮促進miR-34a表達上升，抑制癌基因TGFβ2（圖右）。丹參酮促進let-7表達（圖左）。這些都抑制了非小細胞肺癌肺癌（NSCLC）。

經過我們的再次修改，文章發出的第二天，主編就告知我們決定錄用，這是最快的一種接受方式，說明我們的工作得到了最大的認可。2015年5月，文章在線發表。

2015年6月19日，是個讓人緊張的日子，我指導的碩士研究生張冰潔同學要進行碩士論文答辯了。最終答辯取得非常好的效果，給來自中國科學院上海生化與細胞所及蘇州醫工所的專家們留下深刻的印象。這個來自上海大學的學生終于出色地畢業了，此刻，我心里終于踏實了，夢想也最終成為了現實。

致謝：感謝張冰潔同學（現供職于上海某大型藥企）提供的資料。特別感謝李艷利老師，金由辛教授及課題組老師在學生培養過程給予的幫助。

責任編輯：曹曉晨