龍山卷丹百合黃瓜花葉病毒的檢測

王成龍　源朝政　陳海霞　蔣輝

摘 要：以龍山卷丹百合的病葉為試材，采用DAS-ELISAS檢測法對樣品進行百合黃瓜花葉病毒的檢測，檢出率為75%；提取總RNA為模板，通過RT-PCR擴增其外殼蛋白基因大小為514 bp，和預期條帶大小一致。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該基因片段與Genbank上發(fā)表的CMV CP基因序列同源性達96.7%。

關鍵詞：卷丹百合；RT-PCR；DAS-ELISA；百合黃瓜花葉病毒

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.004

百合聚觀賞、食用和藥用于一體，有重要的經(jīng)濟價值。卷丹百合在湖南栽培歷史悠久，是湖南龍山重要的農(nóng)產(chǎn)品之一。

百合病毒病是繼真菌性病害之后的又一重要病害，發(fā)病率高達40%以上，在一定程度上限制了我國百合的生產(chǎn)，并造成巨大經(jīng)濟損失[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，已報道的百合病毒病有10多種，其中對百合生產(chǎn)危害較大的有3種：百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）發(fā)生最為普遍，百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）主要侵染葉片和花部，表現(xiàn)為斑駁，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） 一般為潛隱侵染，常與百合無癥病毒復合侵染 [3-6]。黃瓜花葉病毒侵染后主要表現(xiàn)為葉片扭曲，葉面和葉脈有黃斑，花有褐色斑點，且植株矮化，如與百合無癥病毒復合侵染，則產(chǎn)生褪綠壞死斑癥狀，目前在多地東方百合栽培品種中已檢測出CMV，并得到病毒分離物[7-11]，但關于湖南龍山卷丹百合感染CMV的報道尚少。為了建立適用于生產(chǎn)實際的百合CMV檢測技術，本研究首先采集龍山卷丹百合基地的病樣，再結合酶聯(lián)免疫法和RT-PCR法的檢測結果進行鑒定，旨在探索建立湖南龍山卷丹百合病毒檢測的技術體系。

1 材料和方法

1.1 DAS ELISA檢測法

1.1.1 材料及主要試劑 檢測樣品：卷丹百合病株樣品采自湖南省湘西州龍山縣百合產(chǎn)區(qū)，田間感病株呈現(xiàn)植株矮縮束頂、部分葉片皺縮、斑駁、條斑和葉脈黃化等生長受阻的癥狀。

陽性對照：即含CMV病毒的樣品，購自上海卡奴生物科技有限公司。

陰性對照：不含CMV病毒的樣品，購自上海卡奴生物科技有限公司。

將0.5 g新鮮百合病葉置于預先加入液氮研缽中充分研磨，再轉移到裝有200 μL裂解液的1.5 mL離心管中，勻漿；4 ℃，15 000 g，離心5 min，棄沉淀，20 ℃保存上清。病毒檢測方法參照CMV DAS-ELISA試劑盒（購自上海卡奴生物科技有限公司）操作步驟進行。

1.1.2 判斷標準 病毒感染結果的判斷標準為：臨界值（CO）=陰性對照均值+0.15；百合黃瓜花葉病毒（CMV）陰性=樣品OD值< 臨界值；百合黃瓜花葉病毒（CMV）陽性=樣品OD值> 臨界值。

1.2 RT PCR檢測法

1.2.1 材料及主要試劑 從田間采集有癥狀的病葉進行DAS-ELISA方法檢測，然后依據(jù)檢測結果，將呈陽性的卷丹百合病葉用于百合黃瓜花葉病毒的RT-PCR檢測。

主要試劑：植物類病毒RNA核酸提取試劑盒（武漢哇哇噻納技術開發(fā)有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生物科技有限公司）；DNA凝膠純化回收試劑盒（Vigene Biotech公司）；RT-PCR反應所采用的試劑High dNTPs-Taq DNA多聚酶、10×PCR Buffer均購于上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 引物設計與合成 根據(jù)NCBI（美國國立生物技術信息中心）已登記的CMV病毒的CP基因序列，利用計算機軟件設計特異性引物。上游引物：5'-CTGCGGATGCCACCTTCA-3'，下游引物：3'-GTGGGAATGCGTTGGTGC-5'，由上海生工生物工程有限公司合成引物，擴增產(chǎn)物預期大小為514 bp。

1.2.3 總RNA的提取和RT-PCR 研缽滅菌待用，稱取0.5 g新鮮的百合病葉放入研缽，加入液氮迅速研成粉末，其他步驟按照RNA核酸提取試劑盒說明書進行。提取的RNA通過1%瓊脂凝膠和溴化乙錠（EB）染色后，進行電泳檢測質量[12]，最后保存在-80 ℃冰箱待用。將提取的卷丹百合病葉的RNA合成cDNA。具體操作步驟按照天根公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行。

反轉錄反應體系為50 μL，其中包括模板cDNA 4 μL， Taq酶0.6 μL，上游和下游引物各1 μL，其他組分和操作步驟參照vitrogen反轉錄酶說明書。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。再取4 μL PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，使用Gene Snap凝膠成像儀拍照。再送樣至南京金斯瑞生物科技有限公司對純化的PCR產(chǎn)物進行測序，最后將測序結果進行同源性比對。

2 結果與分析

2.1 DAS ELISA檢測結果

從圖1的顯色反應結果可知，在12個待檢樣品中顯色為陽性的有9個，不顯色呈陰性的有3個，酶標儀讀取的數(shù)據(jù)結果表明（表1），其中顯色的9個樣品OD值大于臨界值，不顯色的3個樣品OD值小于臨界值，這與顯色反應的結果完全一致，檢出率達75%，從而初步推斷黃瓜花葉病毒侵染了龍山卷丹百合。

2.2 RNA提取

由圖2可見，提取的總RNA條帶清晰，且均無明顯的拖尾現(xiàn)象，通過核酸蛋白檢測儀檢測得知，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，因此說明RNA完整性和純度質量高。

2.3 RT-PCR測序結果及序列分析

以cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。由圖3可知，泳道4、5和6為病葉樣品，呈陽性，確定攜帶黃瓜花葉病毒，該病葉樣品RT-PCR擴增產(chǎn)物條帶約為500 bp，與預期片段大小相符，并與陽性對照片段大小一致，這說明RT-PCR具有一定的特異性，能檢測出卷丹百合病葉中的黃瓜花葉病毒。測序結果表明，黃瓜花葉病毒擴增產(chǎn)物共含有514個核苷酸，將獲得的CMV擴增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST，結果表明與已登錄的荷蘭地區(qū)分離物AJ131618、AJ131619和AJ131615的同源性達96.7%，說明該序列確為CMV序列。從而進一步表明DAS-ELISA檢測呈陽性的百合樣品感染了百合黃瓜花葉病毒。

3 結論與討論

目前，百合病毒病的研究逐漸系統(tǒng)化和清晰化，但主要集中在切花百合的研究上，CMV作為侵染百合的主要病毒之一，雖在世界上已有不少報道，但這是首次在龍山卷丹百合中報道。卷丹百合是龍山特色農(nóng)業(yè)的重要組成部分，栽培歷史長達50多年，近年來栽培面積卻逐年縮減，究其原因主要是多年的無性繁殖，百合病毒病侵染嚴重，導致引種種球質量和產(chǎn)量的降低，打擊了農(nóng)戶的積極性。黃瓜花葉病毒的侵染主要是引起百合花葉病，表現(xiàn)為花葉、葉扭曲、葉面凹凸不平的泡斑；重病植株矮化、鱗片短甚至不能開花[13]。通過產(chǎn)區(qū)的實地調查發(fā)現(xiàn)，植株矮化和葉片簇生現(xiàn)象非常明顯，因此開展龍山卷丹百合病毒病調查意義重大。本研究將采回的病株分別采用DAS-ELISA和RT-PCR檢測技術，對卷丹百合感染CMV的情況進行檢測，確定湖南龍山產(chǎn)區(qū)的卷丹百合已被百合黃瓜花葉病毒感染。

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