膠質瘤組織和細胞系中Nanog基因啟動子區甲基化檢測

汪 炎，牛朝詩，3，李仲穎，楊 洋，賀 虎，程傳東，李 靜

膠質瘤組織和細胞系中Nanog基因啟動子區甲基化檢測

汪 炎1，2，牛朝詩1，2，3，李仲穎1，2，楊 洋1，2，賀 虎1，2，程傳東1，2，李 靜1，2

目的檢測膠質瘤組織和細胞系中Nanog基因啟動子區甲基化狀態與Nanog基因的表達，并探討其在膠質瘤發展中的作用。方法采用甲基化特異性PCR（MSP）法分別檢測正常腦組織、膠質瘤組織、膠質瘤癌旁組織、膠質瘤細胞系U87和U251中Nanog基因啟動子區甲基化狀態，實時定量PCR（RT-PCR）法檢測相應組織和細胞系中Nanog表達情況。結果MSP法檢測膠質瘤組織Nanog基因啟動子區呈非甲基化狀態，且非甲基化檢出率（58.82%）高于癌旁組織（13.63%），差異有統計學意義（χ2＝14.852，P＜0.01）。對MSP法檢測結果行灰度值分析，高級別膠質瘤中Nanog基因啟動子區非甲基化程度高于低級別組。U87和U251細胞系中Nanog基因啟動子區呈非甲基化狀態。RT-PCR結果顯示高級別膠質瘤中Nanog mRNA相對表達量高于低級別組，U87和U251細胞系中NanogmRNA的轉錄明顯增多。結論膠質瘤中Nanog基因啟動子區呈非甲基化狀態，且可能促進Nanog基因的轉錄，影響膠質瘤的發生與發展。

膠質瘤；Nanog；DNA甲基化

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，復發率及死亡率高，其發病機制至今尚不明確，探索其發病機制，尋找有效的治療措施，一直是神經外科的研究重點。Nanog基因是維持胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）自我更新和亞全能性的關鍵因子，在膠質瘤組織和膠質瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）中皆呈陽性表達，促進著膠質瘤的惡性生物學行為［1－3］。基因啟動子區CpG島的非甲基化狀態是癌基因激活的一種重要機制。已有研究［4］表明在生殖細胞腫瘤中，Nanog基因啟動子區CpG島呈非甲基化狀態促進Nanog的轉錄，維持著腫瘤細胞未分化的特性。該研究探討人腦膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中Nanog啟動子區甲基化狀態與Nanog基因表達的關系，為研究膠質瘤的發生與發展提供可能的分子依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源選用安徽醫科大學附屬省立醫院神經外科2012年2月～11月手術切除膠質瘤標本51例和相應癌旁組織22例。51例膠質瘤標本術后經病理檢查確診，根據WHO 2007中樞神經系統腫瘤分類標準進行分級：Ⅰ級7例，Ⅱ級10例，Ⅲ級16例，Ⅳ級18例。正常腦組織標本12例取自顱腦損傷行內減壓術的病患，術后病理檢查證實均為正常腦組織，無膠質細胞增生和壞死。標本取得后于10 min內置入－80℃冰箱中冷凍保存。

1.2 細胞系與主要試劑人腦膠質瘤細胞系U87、U251（中國科學院上海細胞所）。細胞培養液DMEM／F12、進口胎牛血清及胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DNA提取試劑盒（中國天根公司）；EZ DNA Methylation Kit（美國ZYMO RESEARCH公司）；Oligod（T）18、Ex Taq DNA聚合酶、Marker D2000、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ實時定量試劑盒、Prime-Script RT-PCR Kit、Nanog和GAPDH Real-time PCR引物設計合成（日本TaKaRa公司）；Nanog甲基化和非甲基化引物合成由上海生工生物公司完成；其他常規試劑為進口或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人腦膠質瘤細胞系U87、U251置于10%胎牛血清、100 U／m L青霉素／鏈霉素的DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，常規傳代。

1.3.2 甲基化特異性聚合酶鏈式反應（methylationspecific polymerase chain reaction，MSP）

1.3.2.1 DNA提取 使用DNA提取試劑盒，按照說明書操作，分別從膠質瘤組織、癌旁組織、正常腦組織及細胞中提取基因組DNA。使用酶標儀（瑞士TECAN Infinite200）測定提取DNA樣本的純度和濃度。

1.3.2.2 DNA甲基化修飾 每份標本取5μg DNA作為模板，加ddH2O至20μl。使用EZ DNAMethylation Kit試劑盒，對樣本進行亞硫酸鹽處理并純化，甲基化修飾后的DNA保存于－20℃備用。

1.3.2.3 PCR擴增 以甲基化修飾后的DNA為模板，分別用Nanog基因啟動子區特異甲基化和非甲基化引物行PCR擴增反應，ddH2O替代DNA樣本作為陰性對照。引物設計參考文獻［5］，其中甲基化引物序列：5′-TTAATTTATTGGGATTATAGGGGTG-3′（上游），5′-AAACCTAAAAACAAACCCAACAAC-3′（下游），非甲基化引物序列：5′-ACTGTCTCTCCTCTTCCCTC-3′（上游），5′-CCTGTTTGTAGCTGAGGTTC-3′（下游）。PCR反應體系（10μl）：cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5μl，Ex Taq DNA聚合酶5μl，ddH2O 3μl。反應條件：94℃預變性10 min后，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環，72℃延伸10 min。取PCR產物10μl置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，采用BIO-RAD凝膠成像系統進行凝膠成像，Quantity One軟件行灰度值分析。

1.3.3 Real-time PCR檢測Nanog表達 TRIzol-氯仿-異丙醇法提取膠質瘤組織和細胞系中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA。在美國ABI Prism 7500快速實時定量PCR儀上進行Real-time PCR反應，條件：95℃預變性30 s后，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，共35個循環。反應體系（20μl）：cDNA模板2μl，上下游引物各0.8μl，SYBR Premix EX TaqTMⅡ（2×）10 μl，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl，ddH2O 6 μl。所有樣品設3個復孔。記錄每個反應管中的熒光信號達到閾值所經歷的循環數Ct值，以GAPDH為內參，得到Nanog的相對表達量。Nanog上游引物：5′-CCTGTGATTTGTGGGCCTGA-3′，下游引物：5′-CTCTGCAGAAGTGGGTTGTTTG-3′，片段大小為168 bp。GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，片段大小為138 bp。PCR結果判斷：ΔCt＝Ct目的基因－Ct內參，ΔΔCt＝（Ctnanog－Ctgapdh）高級別－（Ctnanog－Ctgapdh）低級別，RQnanog＝2－ΔΔCt［6］。

1.4 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據以±s表示。計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 膠質瘤組織中Nanog基因啟動子區甲基化狀態Nanog基因啟動子區甲基化引物和非甲基化引物擴增片段長度分別為213 bp和225 bp。51例膠質瘤標本中，30例標本檢測出Nanog基因啟動子區呈非甲基化狀態，而22例癌旁組織中僅有3例檢測出非甲基化，兩者差異有統計學意義（χ2＝14.852，P＝0.000）。正常腦組織中未檢測出非甲基化的表現。Nanog啟動子區非甲基化率在膠質瘤WHOⅠ級、WHOⅡ級、WHOⅢ級、WHOⅣ級標本中分別為42.9%（3／7）、50.0%（5／10）、62.5%（10／16）、66.7%（12／18），各病理級別之間差異無統計學意義（χ2＝1.605，P＝0.658）。對目的條帶行灰度值分析，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤的灰度值明顯高于Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤（t＝6.988，P＝0.000）。Nanog啟動子區非甲基化程度隨著膠質瘤病理級別的增加而升高。見圖1。

2.2 膠質瘤組織中Nanog啟動子甲基化和其mRNA表達的關系Nanog和GAPDH擴增產物的溶解曲線顯示均為單峰，表明擴增產物單一，無非特異性擴增；擴增曲線顯示Nanog呈指數增長，并進入平臺期，表明擴增效率高。見圖2、3。Nanog啟動子區非甲基化陽性的30例標本中檢測出28例發生Nanog的轉錄，而未發生非甲基化的21例中有15例檢測出Nanog的轉錄，兩者差異有統計學意義（χ2＝4.482，P＝0.034）。癌旁組織和正常腦組織中均未檢測出Nanog的表達。以GAPDH為內參、低級別中Nanog表達量為基準，低級別和高級別膠質瘤中Nanog的相對表達量分別為（1.24±0.61）、（4.53± 0.91），高級別膠質瘤Nanog表達相對于低級別膠質瘤明顯升高（t＝11.41，P＝0.00）。見圖4。

2.3 膠質瘤細胞系中Nanog啟動子甲基化和其mRNA表達的關系MSP法檢測顯示U87、U251細胞系中Nanog啟動子區非甲基化引物擴增出目的條帶，而甲基化引物未擴增出條帶。說明U87、U251細胞系中Nanog啟動子區呈非甲基化狀態。Realtime PCR結果顯示，在U87、U251細胞系中發生了Nanog基因的轉錄。見圖5。

3 討論

Nanog是近年來在ESCs內發現的一個重要轉錄因子，該因子對維持ESCs的自我更新及亞全能性起著關鍵作用，是全能性或多能性干細胞標志物［6］。本課題組前期研究［1－3］顯示，Nanog在膠質瘤中高表達并隨著病理級別的增高其表達增多；在GSCs中Nanog亦呈高表達，且顯著高于U87膠質瘤細胞系，表明Nanog是一種與分化緊密相關的重要調節因子，并作為候選癌基因調節膠質瘤的生物學行為。

腫瘤是由于表觀遺傳和遺傳異常共同作用，導致基因表達失調而發生的。表觀遺傳學包括組蛋白修飾、RNA干擾、DNA甲基化、染色質重塑等，精確調控著基因表達，而不改變基因的序列［7］。基因啟動子區CpG島的呈現出非甲基化狀態是激活癌基因的一種重要機制。Nanog啟動子區散在分布著組織依賴差異的DNA甲基化區域（T-DMR）。T-DMR在ESCs中非甲基化，使Nanog得以表達，而在滋養層干細胞（trophoblast stem cells，TSCs）中呈高甲基化，使Nanog表達失活［8］。在胚胎癌細胞中Nanog啟動子區CpG位點未發生DNA甲基化，而在293T細胞中有67%甲基化，將293T用胚胎癌提取物處理4周后，甲基化的CpG位點下降到39%［9］。Nettersheim et al［4］發現在生殖細胞腫瘤中OCT4與SOX2介導的Nanog表達可以被Nanog啟動子區CpG島的高甲基化所沉默，并且發現生殖細胞腫瘤的分化狀態與Nanog啟動子區CpG島的甲基化程度密切關聯。

本研究顯示，腦膠質瘤中Nanog啟動子區非甲基化率明顯高于癌旁組織和正常腦組織，表明Nanog啟動子區非甲基化在膠質瘤中是一個頻發事件且有著顯著的腫瘤特異性。非甲基化陽性組中NanogmRNA的表達明顯高于陰性組，高級別膠質瘤中Nanog啟動子區非甲基化程度高于低級別組，NanogmRNA的轉錄水平亦明顯升高，前期的免疫組化和Western blot結果顯示，Nanog的蛋白表達強度隨著膠質瘤組織的病理級別的升高而增強，提示Nanog啟動子區非甲基化是導致Nanog蛋白表達增強的重要機制［1］。Nanog啟動子區在U87、U251細胞系中皆呈非甲基化狀態，且在U87、U251細胞系亦檢測到Nanog基因的轉錄，進一步證明Nanog啟動子區非甲基化狀態促進Nanog的表達，維持腫瘤細胞的低分化或未分化狀態。

本實驗中擴增的Nanog啟動子區片段是位于其轉錄起始位點上游－200 bp區域，此區域中包含著與轉錄因子Oct4／Sox2的結合位點（－104 bp～－108 bp）［7］，對Nanog的調控起著重要作用。有研究者利用電泳遷移變動分析和染色質免疫共沉淀實驗證明，Oct4和Sox2確實能在體外和體內結合到Nanog的啟動子上［18］。對該位點進一步的誘變分析表明，Oct4／Sox2對于Nanog啟動子活性是必不可少的，并能在多能性細胞中提高Nanog的轉錄。結合本研究結果，在膠質瘤中該區域的CpG島呈非甲基化狀態，更有利于Oct4、Sox2與Nanog啟動子區的結合，促進Nanog的表達。

綜上所述，人腦膠質瘤中Nanog基因啟動子區非甲基化模式與Nanog的表達有著密切的相關性。通過改變膠質瘤中Nanog啟動子區原有甲基化模式，是否能夠下調Nanog的表達從而抑制膠質瘤細胞的惡性生物學活性還有待進一步研究。

［1］ Niu C S，Li D X，Liu Y H，et al.Expression of NANOG in human gliomasand its relationship with undifferentiated glioma cells［J］. Oncol Rep，2011，26（3）：593－601.

［2］ 李冬雪，牛朝詩，劉于海，等.Nanog基因在腦腫瘤干細胞中的表達及其意義［J］.中華神經外科雜志，2011，27（2）：125－30.

［3］ 李冬雪，牛朝詩，劉于海，等.膠質瘤組織中Nanog基因的表達及其意義［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2010，8（6）：504－8.

［4］ Nettersheim D，Biermann K，Gillis A J，et al.NANOG promoter methylation and expression correlation during normalandmalignant human germ cell development［J］.Epigenetics，2011，6（1）：114－22.

［5］ Deb-Rinker P，Ly D，Jezierski A，et al.Sequential DNA methylation of the Nanog and Oct-4 upstream regions in human NT2 cells during neuronal differentiation［J］.JBiol Chem，2005，280（8）：6257－60.

［6］ Silva J，Nichols J，Theunissen TW，et al.Nanog is the gateway to the pluripotent ground state［J］.Cell，2009，138（4）：722－37.

［7］ Jones PA，Baylin SB.The epigenomics of cancer［J］.Cell，2007，128（4）：683－92.

［8］ Hattori N，Imao Y，Nishino K，et al.Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells［J］.Genes Cells，2007，12（3）：387－96.

［9］ Freberg C T，Dahl JA，Timoskainen S，et al.Epigenetic reprogramming of OCT4 and NANOG regulatory regions by embryonal carcinoma cell extract［J］.Mol Biol Cell，2007，18（5）：1543－53.

Analysis and significance of Nanog promoter methylation status in gliomas and gliom a cells

Wang Yan1，2，Niu Chaoshi1，2，3，Li Zhongying1，2，et al
（1Dept of Neurosurgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001；2Anhui Province Key Laboratory of Brain Function and Brain Disease，Hefei 230001；3Anhui Provincial Stereotactic Neurosurgical Institute，Hefei 230001）

Objective To detect themethylation status of Nanog gene promoter and the expression of NanogmRNA in gliomas and glioma cell lines，and to explore the function of Nanog in glioma.MethodsMSP and RT-PCR were conducted to detect Nanog gene promoter′smethylation statusand itsmRNA expression in normal brain tissues，glioma tissues，paracancerous tissues，glioma cell lines U87 and U251.ResultsNanog gene promoter was hypermethylated in gliomas，and the presence was significantly higher in gliomas than that in the paracancerous tissues（58.82%vs13.63%）（χ2＝14.852，P＜0.01）.Nanog gene promoter unmethylation state was higher in gradeⅢand gradeⅣglioma compared with grade Iand gradeⅡtumors.Nanog gene promoterwas hypermethylated in U87 and U251 cell lines.Nanog mRNA expression levels in high-grade（Ⅲ＋Ⅳ）gliomas were higher than the lowgrade（I＋Ⅱ）group，NanogmRNA expression was significantly increased in U87 and U251 cell lines.ConclusionUnmethylation state of Nanog gene promoter regions is one of themost importantmechanisms thatup-regulate its protein expression and influence the occurrence and development of gliomas.

glioma；Nanog；DNA methylation

R 739.41

A

1000－1492（2015）08－1068－04

2015－04－22接收

國家自然科學基金（編號：81172407）；安徽省重點實驗室績效考核項目（編號：1306c083028）

安徽醫科大學附屬省立醫院1神經外科、2腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室、3安徽省腦立體定向神經外科研究所，合肥 230001

汪 炎，男，碩士研究生；

牛朝詩，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：niuchaoshi＠163.com