足細胞自噬在足細胞病中的研究進展

黃 勇綜述 曹式麗審校

◇綜 述◇

足細胞自噬在足細胞病中的研究進展

黃 勇1綜述 曹式麗2審校

對近年來足細胞自噬在足細胞病中的作用及其機制的研究進行了概述，闡述了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在足細胞自噬中扮演的角色。足細胞自噬活性的改變與足細胞病的進程密切相關，mTOR信號通路介導的自噬途徑是足細胞保持自身穩定的重要調節器，以調控足細胞自噬平衡體系為干預靶點可能成為足細胞病防治的新靶點。

自噬；足細胞自噬；足細胞病；mTOR

足細胞即腎小球臟層上皮細胞，是一種高度分化的終末細胞，其結構和功能的正常對維持腎小球濾過屏障的完整性非常重要。自噬是近年來細胞生物學領域研究的熱點。自噬過度、障礙造成的細胞損傷及其誘導的細胞程序性死亡在疾病的發生、發展過程中起著重要作用。自從發現腎小球足細胞中存在自噬現象，足細胞自噬在足細胞病發生、發展中所扮演的角色已成為新的研究方向。該文就近年來足細胞自噬在足細胞病中的研究進展及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路在足細胞自噬中扮演的角色進行闡述。

1 自噬與細胞的生理病理

自噬是一種廣泛存在于真核細胞內溶酶體依賴性蛋白及細胞器的分解代謝途徑。目前研究將自噬分為三種：巨自噬、微自噬和分子伴侶自噬［1］。其中巨自噬指細胞質中可溶性蛋白和變性壞死的細胞器被非溶酶體來源的雙層膜結構所包裹，繼而被溶酶體內水解酶降解的過程；微自噬中溶酶體膜內疊，使得一部分細胞質直接進入溶酶體腔而被分解；分子伴侶自噬需要細胞質可溶性蛋白直接通過溶酶體膜，預先有伴侶分子將目標蛋白解構變性。而自噬通常是指巨自噬，是其中研究最多的一種。自噬是胞質中大分子物質和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程，其過程大致包括4個階段［2］：①隔離膜的形成：在饑餓、氧化應激損傷等自噬誘導因素的刺激下，粗面內質網的非核糖體區域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形成杯狀隔離膜，包裹在需降解的蛋白質或細胞器周圍；②自噬體的形成：隔離膜逐漸延伸，將需降解的底物完全包繞形成自噬體；③自噬性溶酶體的形成：自噬體通過細胞骨架微管系統將其包裹的底物運輸至溶酶體，并與之融合形成自噬性溶酶體；④自噬體內容物的降解：自噬體與溶酶體融合后，自噬體內膜及其內容物被溶酶體中多種蛋白水解酶降解，自噬體膜脫落循環利用。

生理狀態下，幾乎所有細胞都存在基礎水平的自噬。正常水平的自噬可以清除未折疊或折疊錯誤的蛋白質，降解蛋白質產生氨基酸等供細胞再循環，從而維持細胞生存及內環境的穩定。自噬可被多種因素激活，如營養或生長因子缺乏、缺氧、活性氧刺激、DNA損傷、蛋白質聚集、細胞器損傷或細胞內病原體侵襲等因素［3］。在大多數情況下，自噬參與細胞的應激反應，幫助細胞適應營養變化，維持細胞穩態，延續細胞生命，是細胞對外界因素刺激的一種適應性反應，是細胞的一種自我保護機制，可阻抑有害應激所誘導的細胞凋亡［4］。對于腫瘤細胞，自噬具有抑制和促進的雙重作用，如在腫瘤發生初期自噬活性的增強可作為一種抑制因素，而在腫瘤生長過程中卻可為腫瘤擴增提供營養，促進腫瘤細胞的增殖，而且自噬在不同類型腫瘤中扮演的角色亦不相同［5］。因此，自噬與細胞的生理和病理關系密切。目前研究對自噬在疾病中所扮演的角色尚無定論，探索其在不同疾病中的作用及其具體作用機制具有重要意義。

2 足細胞自噬與足細胞病

2002年足細胞病的概念首次被提出，以腎小球足細胞數量和（或）密度減少、腎小球基底膜增厚、腎小球基質成分改變、足突融合等為特征的腎小球疾病統稱為足細胞病。足細胞是一種高度分化的終末細胞，其足突包繞在腎小球基底膜上，形成裂孔隔膜復合體，其結構的完整性與腎小球濾過屏障功能的正常密切相關。足細胞的損傷和缺失是導致腎臟疾病發生及發展至腎功能衰竭的主要原因，足細胞數量的減少是預測腎臟疾病進展的重要指標［6］。成熟足細胞缺失后僅能依賴于足細胞的祖細胞再生，其再生能力極其微弱。且初始的局部損傷的足細胞可產生“多米諾效應”，將損傷信號傳遞至正常足細胞，使疾病迅速發展至腎小球硬化［7］。因此，維護足細胞結構和功能的正常，阻抑足細胞的損傷是腎臟病防治的重要環節。

自噬在腎臟疾病的研究已歷經半世紀。1956年，Clark［8］通過電鏡觀察到小鼠腎組織細胞中存在大量具有膜性結構的致密體，并發現其胞質中常含有類似于線粒體的結構。當時學者們對自噬了解尚少，對自噬這一現象也沒有明確定義。1983年，Berkenstam et al［9］從大鼠近端腎小管細胞中分離出自噬性囊泡，證明大鼠腎臟固有細胞中存在自噬現象，自噬在腎臟病領域開始受到關注。2003年Asanuma et al［10］發現足細胞的分化和損傷修復過程存在自噬現象。加之同期足細胞病概念的提出，使得眾多研究者開始探索足細胞自噬在足細胞病中所扮演的角色。Mizushima et al［11］通過綠色熒光蛋白標記LC3（green fluorescent protein marked LC3，GFPLC3）轉基因小鼠模型發現腎小球足細胞顯著表達自噬，提示足細胞中存在基礎自噬活性。Hartleben et al［12］用GFP-LC3作為自噬體免疫熒光標志物來檢測機體內自噬水平，發現腎小球足細胞中LC3-Ⅱ的堆積速度明顯高于腎臟其他細胞，說明足細胞相比于腎臟其他細胞表達出更高的自噬水平。且足細胞基礎自噬活性是維持足細胞結構及功能完整性的重要機制，足細胞自噬平衡體系失衡會增加腎小球疾病易感性。糖尿病腎病是一種常見的足細胞病，高糖刺激可以引起足細胞自噬活性受到抑制，給糖尿病小鼠腹腔注射雷帕霉素可以減輕腎小球病理改變和足細胞損傷，其作用可能與促進足細胞自噬有關［13］。在腎活檢病理表現為微小病變（minimal change disease，MCD）的患者中，足細胞自噬相關基因Beclin-1表達明顯高于局灶節段性腎小球硬化（focal segmental glomerular sclerosis，FSGS）患者，且對MCD患者重復腎活檢時發現，Beclin-1表達無明顯變化者其病理類型仍為MCD，而Beclin-1表達明顯下降、足細胞自噬活性降低者腎臟病理已轉化為FSGS［14］，說明足細胞自噬活性的改變與足細胞病的進程密切相關。上述研究結果提示：以調控足細胞自噬平衡體系為干預靶點或可為足細胞病的治療提供新的可行途徑。

3 m TOR信號通路——足細胞自噬“調節器”

細胞通過自噬來循環利用破損和無用的細胞器及大分子，同時產生能量，并恢復正常生長所需要的構件前體。mTOR和細胞自噬有著緊密聯系，在mTOR和細胞自噬聯系出現缺陷的地方，可引起腫瘤和神經退行性病變等一系列疾病的發生［15］。mTOR是細胞內一種高度保守的絲／蘇氨酸（Ser／Thr）蛋白激酶，其作為能量代謝的調控器，可整合營養、生長因子以及多種細胞外信號，參與基因轉錄、蛋白質的翻譯、核糖體的合成等生物過程，在維持細胞的結構和功能中發揮著重要的作用［15］。參與調節足細胞自噬平衡體系的分子系統非常復雜，目前研究主要集中在mTOR、核轉錄因子等信號通路。其中，mTOR是生理及應激條件下協調生長與自噬之間平衡的關鍵成分，是多條信號通路的匯聚點，成為目前自噬相關信號通路研究的熱點。

mTOR屬磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide-3 kinase ELISA Kit，PI3K）相關蛋白激酶家族，具有Ser／Thr蛋白激酶活性，能磷酸化蛋白底物的Ser／Thr殘基。細胞內存在mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR復合物2（mTOR complex 2，mTORC2）兩種復合體。mTORC1復合體由mTOR蛋白和分別對復合體起正負調節作用的mTOR調控相關蛋白Raptor、Deptor等附屬蛋白組成，主要參與調節細胞生長、細胞凋亡、能量代謝和細胞自噬等［16］。mTORC2構成包括Rictor及mSin1，通過磷酸化蛋白激酶C-a（protein kinase phosphorylation ca，PKC-a）通路來調節肌動蛋白，在肌動蛋白細胞骨架、細胞存活及代謝等方面發揮重要作用［17］。由于mTOR-Rictor復合物不能結合FKBP12-雷帕霉素耦聯體，mTORC2對雷帕霉素表現為不敏感。而最近研究［18］顯示延長雷帕霉素治療時間可以影響Rictor與mTORC2的結合。細胞自噬的起始階段是由ULK1及VPS34兩種蛋白激酶調控，ULK1是VPS34的上游蛋白，ULK1會在細胞缺乏營養的時候激活，ULK1和VPS34的激活使自噬基因（autophagy-related gene，ATG）蛋白聚集形成吞噬泡膜從而促進自噬體的成熟，同時，ULK1和VPS34還能與mTORC1信號產生相互作用從而影響自噬［19］。mTORC1參與自噬的調節與PI3K／蛋白激酶B（Akt）信號通路密切相關。磷酸肌醇三磷酸（inositol triphosphate phosphate，PI3P）在這個過程中是一個重要的細胞內信號，其可與多種具有同源性底物的蛋白質相結合，如磷脂酰肌醇依賴性激酶1和Akt，PI3P與PDK1的結合可使Akt磷酸化、激活，激活的Akt進一步使細胞核和細胞質中的其他目標蛋白磷酸化，從而抑制mTORC1的激活，提高細胞內的自噬活性［20］。此外，mTOR磷酸化的ATG13會降低ATG13和ATG1的親和力，而ATG1-ATG13的聯合以及下一步ATG1的激活對細胞自噬非常重要，因此在細胞營養充分時，mTOR誘導的ATG1解離有效阻止了細胞自噬［21］。上述研究提示，mTOR介導的自噬途徑是細胞自噬的重要調節器，且這一過程受多種細胞因子及信號的影響。

基礎狀態下，足細胞依賴于極低水平的mTOR活性及高水平的自噬活性以維持自身動態平衡。當腎小球應激下改變這種平衡，導致mTOR活性增強和自噬活性減弱，則會造成足細胞損傷。Raptor和Rictor分別是mTORC1和mTORC2非常重要的亞單位。Godel et al［22］通過特異性敲除足細胞Raptor和Rictor顯示，剔除Raptor導致蛋白尿，足突變寬和消失，進行性腎小球硬化；而剔除Rictor的足細胞只是在應激（如用牛血清蛋白刺激）情況下表達出極小的表型變化，提示mTORC2對足細胞的作用不是十分明顯；而同時剔除了Raptor和Rictor的足細胞直接導致腎臟衰竭和快速死亡。提示mTORC1活性降低可導致足細胞損傷，Raptor和Rictor兩者都敲除比單獨敲除其中一個導致更嚴重的足細胞損傷，mTORC1和mTORC2在足細胞發育中起著重要的協同作用。此外，研究［23］表明過度激活mTORC1會引起小鼠腎小球系膜擴張、足細胞胞體增大、足突消失、腎小球硬化，并在14周齡時因腎衰竭而死亡。這些研究［22－23］提示，體內不表達或過度表達mTORC1都會導致足細胞結構和功能的改變。糖尿病高血糖狀態下mTOR過度表達，自噬被抑制，這種持久性的刺激導致足細胞衰退，出現蛋白尿及腎小球硬化。在給予糖尿病腎病小鼠雷帕霉素后，發現足突融合明顯減少［24］。而雷帕霉素參與調節足細胞自噬的機制可能在于其與FK-結合蛋白12（FK-BP12）相結合，形成RPM／FKBP12復合物，阻礙Raptor和mTOR結合，從而影響mTORC1活性，阻止細胞周期中G1期向S期轉化，阻斷細胞鈣依賴性和非鈣依賴性的信號傳導通路，從而抑制蛋白質翻譯的啟動而實現［25］。

綜上所述，自噬普遍存在于真核細胞中，可以清除細胞中損傷或衰老的細胞器及生物大分子，具有保護細胞的作用。自噬是足細胞的一種自我保護機制，自噬體系失衡與足細胞病的發生、發展密切相關。隨著研究的不斷深入，其在足細胞病中的具體作用機制也將逐步明朗。尋求一種有效調控足細胞自噬平衡體系以阻抑足細胞損傷的途徑是目前亟待解決的問題。從自噬的角度出發，有效調控腎小球足細胞自噬內穩態的重要“調節器”——mTOR信號通路，或可為足細胞病的防治提供新思路。

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R-1

A

1000－1492（2015）08－1200－04

2015－03－25接收

國家自然科學基金（編號：30772808）

1天津中醫藥大學研究生院，2天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，天津 300193

黃 勇，男，博士研究生；

曹式麗，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：shilicaoTCM＠163.com