基于隨機引物PCR的幾種分子標記技術的概述

李松濤 高立霞 張麗君 曹宏偉 孔青

(山東醫藥技師學院,山東泰安 271016)

基于隨機引物PCR的幾種分子標記技術的概述

李松濤 高立霞 張麗君 曹宏偉 孔青

(山東醫藥技師學院,山東泰安 271016)

本文綜述了各種基于隨機引物PCR(Polymerase Chain Reaction)的分子標記技術,包括隨機擴增多態性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、任意引物PCR(Abitrary Primer PCR,AP-PCR)、DNA?擴增指紋分析(DNA Amplification Fingerprinting,DAF)以及此后在此基礎上改進的其他技術,如序列特異性擴增(sequence characterized amplified region,SCAR)、相關序列擴增多態性(sequence-based amplified polymorphism, SRAP)等,就以上分子標記技術的原理、操作步驟、優缺點進行簡要概述。

分子標記 RAPD AP-PCR SCAR

隨著分子生物學研究的逐漸深入，越來越多的分子標記技術被人們發現并運用，這些技術反過來又促進了分子生物學的發展。目前，分子標記技術按實驗方法不同可分為：基于分子雜交的分子標記技術，基于隨機引物PCR的分子標記技術，和基于特異引物PCR的分子標記技術。基于隨機引物PCR的分子標記技術是在PCR的基礎上發展而來，現在已廣泛應用于物種鑒別、遺傳多樣性分析、親緣關系分析等研究領域。

基于隨機引物PCR的分子標記技術最早發現于20世紀90年代初。1990年美國杜邦公司williams等用10堿基的寡核苷酸作為引物擴增多態性DNA成功，并將此技術命名為隨機擴增多態性DNA (Randomly Amplifi ed Polymorphic DNA，RAPD)[1]。同時期，Welsh和McClelland發明了AP-PCR[2]，Caetano-Anolles發明了DAF[3]。

RAPD、AP-PCR、DAF三種技術極為相似，都是利用PCR，以隨機序列寡核苷酸為引物，對目標基因組DNA進行多態性擴增。當然它們之間也存在一些差別，比如三種技術的隨機引物長度有所不同。三種技術中，RAPD更為常用。Franck A.Atienzar等人曾統計，自1990年至2005年，OVID數據庫收載的有關RAPD的論文高達8493篇，而AP-PCR、DAF分別約為500篇和150篇[4]。

1 RAPD技術

1.1 技術原理

基因組中存在著豐富的反向重復序列，根據這一特點，RAPD利用隨機的寡核苷酸片段作為單一引物對基因組進行PCR擴增。單一引物與上下游的反向重復序列結合，兩位點之間的DNA序列就被擴增出來，形成此基因組特異的DNA片段。很多從同一基因組DNA上擴增出來的不同分子量的條帶構成了這個基因組的DNA指紋。不同來源的基因組，DNA指紋不同，此即DNA多態性。RAPD結果的多態性源自被擴增區域的染色體不同或引物結合位點的堿基改變。

雖然一條引物檢測的多態性有限，但是RAPD實驗通常利用多條引物分別對DNA擴增，因而檢測區域可能覆蓋整個基因組。

1.2 操作步驟

RAPD實際上是一種特殊的PCR，與普通PCR不同之處在于其選用單一隨機引物，且退火溫度較低。基本步驟可概括為：(1)提取基因組DNA；(2)用10堿基的隨機引物，對基因組DNA進行PCR。PCR條件各實驗室有所不同，退火溫度一般在36℃左右，循環數一般為40-45個循環。(3)PCR產物進行瓊脂糖電泳并在紫外燈下觀察。(4)分析結果。記錄各物種多態性條帶的1/0數據，用spss軟件計算任意兩物種間的相似性系數，或PAUP軟件進行聚類分析，建樹狀聚類圖。

1.3 優缺點

與其他分子標記技術相比，RAPD具有以下優點：(1)RAPD不需高端實驗設備，只要PCR儀和電泳裝置即可滿足實驗要求。RFLP等分子標記技術需要進行southern blotting、同位素標記等復雜或放射性實驗[5，6]。相比之下，RAPD實驗操作更簡便安全。(2)RAPD的分析對象DNA，在生命體中廣泛存在易獲取。提取植物DNA，一般不需考慮葉片采集時間，但幼葉中酚的含量較少易于純化。此外，RAPD所需DNA量相對較少，且蛋白質、RNA污染對實驗結果影響不大[7]。(3)引物設計簡易，無需知道基因組DNA信息，隨機設計10堿基的寡核苷酸序列即可作為引物。(4)由于RAPD所用的隨機引物，有些可以擴增DNA的高度保守序列，因此可以將多樣性定在較高分類水平。同樣，有些引物擴增的是DNA的高度可變區，因而可以用于低水平的種間或種內多樣性分析。

盡管RAPD有著諸多優點，但也存在著一些缺陷：首先，RAPD是顯性標記，無法有效區分基因組DNA為純合子還是雜合子；其次，通過RAPD可鑒別出基因多態性，卻無從知道多態性位點，也不能確定此位點基因是否影響生物體表型；最重要的是，相對于其他分子標記實驗，RAPD技術的可重復性較低[8]。因此，實驗中還需摸索DNA含量、模板含量退火溫度等信息，以提高可重復性[8，9]。

2 AP-PCR技術

AP-PCR是同時期發現的與RAPD相似的技術。與RAPD相比，AP-PCR引物稍長，一般為20個堿基，且濃度是RAPD的10倍。此外，AP-PCR的PCR操作略顯復雜，其過程可分為兩個階段。第一個階段，低嚴謹條件下的擴增。此階段的退火溫度較低，因而引物與模板結合時錯配較多，這一階段進行兩個循環。第二階段，高嚴謹條件下的擴增。此階段退火溫度高，約為60℃，在低嚴謹退火條件下發生的延伸引物可以繼續在高嚴謹條件下進行擴增。為了得到更清晰的結果，在反應最后的20到30個循環還可加入放射性的32-PdCTP。

AP-PCR最顯著的特點是兩個低嚴格性的退火循環，它使PCR的錯配處在一個較高的水平，這樣檢測的多態性更豐富。另外，在有些實驗中采用放射性的dCTP作原料，合成DNA條帶具有放射性。

3 DAF技術

DAF，也是與AP-PCR、RAPD同時期發現的原理相似的分子標記技術。DAF的單一引物長度更短，一般在5-8個堿基之間，因此多態性更大。條帶比RAPD和AP-PCR都多，因而檢測出樣本之間多態性的可能性會增加。

4 SCAR技術

SCAR(sequence characterized amplified region，序列特異性擴增)是以RAPD為基礎發展起來的。與RAPD相比其優勢在于，可以確定多態性DNA條帶的堿基序列，并將顯性標記轉化為共顯性標記，因此在遺傳學上具有重要意義。

在SCAR中，首先要進行RAPD-PCR，擴增出產物后，切割感興趣的條帶并進行測序，然后根據測定序列在原引物3’端添加14個堿基，構成24堿基的引物再進行擴增。SCAR因引物更長，退火溫度高，引物與模板結合更具特異性，結果也更準確。SCAR是共顯性標記，如果要做顯性標記則第二次PCR之后只需染色、不用電泳。

SCAR主要用于將RAPD顯性標記轉化為共顯性標記，以確定基因組是否為純合子。謝傳曉等人把與玉米對生葉突變體對生性狀兩個顯性位點緊密連鎖的RAPD標記成功轉化成SCAR標記，為對生玉米的分子標記輔助選擇奠定了基礎[10]。在某些情況下，為了增加實驗的穩定性和可靠性，也可將RAPD轉化為SCAR，如吳學謙等將SCAR標記用于香菇菌株鑒定上，構建了穩定、準確鑒定香菇菌株的新方法[11]。

5 SRAP技術

SRAP(sequence-based amplified polymorphism，相關序列擴增多態性)，又稱為SBAP(sequence-based amplified polymorphism，基于序列擴增多態性)，是于2001年由美國加州大學蔬菜系Li與Quiros博士建立起來的對外顯子進行分析的技術[12]。

SRAP與RAPD的最大不同在于其獨特的引物設計。SRAP基于外顯子富含GC而啟動子和內含子富含AT的特點來設計引物，以實現對開放閱讀框架(ORF)進行擴增。SRAP所用為一對引物而不是單一引物：上游引物5’端前10個為填充序列，接著是CCGG，3’端是三個選擇堿基；下游引物5’端前11個是填充序列，接著是AATT，3’端是三個選擇堿基。引物的設計是SRAP實驗成功的關鍵：上游引物、下游引物的長度必須不同，且應注意引物內、引物間不能形成“發夾”等二級結構。

SRAP多態性主要來自于兩方面：一方面，插入和缺失導致的片段長度的改變由此產生的多態性，此時SRAP可用做共顯性標記；另一方面，核苷酸改變而產生的多態性，此時SRAP只能用作顯性標記。

6 RAMPO

RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism，隨機擴增微衛星多態性)，又稱為RAHM(random amplifi ed hybridization microsatellites，隨機擴增雜交微衛星)。為了從RAPD中獲得更多的多態性信息，在PCR擴增之后，用SSR探針對擴增產物進行southern印跡，這一方法被稱為RAMPO或RAHM[13]。SSR探針主要結合在擴增產物的微衛星序列上，因此RAMPO可以從RAPD凝膠上獲得更多有關微衛星基因克隆的信息。

7 MS-RAPD(Methylation-Sensitive Random Amplified Polymorphic DNA,甲基敏感隨機擴增多態性DNA)

通常DNA多態性是指堿基序列的多態性，但是DNA的甲基化在基因表達調節中起著至關重要的作用。目前，有很多檢測DNA甲基化的技術，如，亞硫酸氫鹽測序(bisulfi te sequencing)，甲基化CPG島復原分析(MIRA)，甲基敏感多態性擴增等。其中甲基敏感多態性擴增就是一種基于隨機引物PCR的分子標記技術，它包括MSAP-PCR[14]和MS-RAPD[15，16]。

在進行MS-RAPD時，首先利用甲基化敏感的限制性內切酶MSPⅠ、HapⅡ對DNA進行切割，然后將獲得的DNA片段進行隨機擴增得到多態性DNA。MS-AP-PCR與MS-RAPD技術極為相似，不同在于MS-RAPD最后檢測時采用瓊脂糖膠，而MS-AP-PCR采用測序凝膠。

8 結語

分子標記作為新的遺傳標記，具有簡單、高效、重復性好、穩定和易測序等的優點。其中基于隨機引物PCR的分子標記，由于不需要合成特定引物就可以檢測DNA的多態性，并且不依賴于基因組結構和種屬特異性，現已在物種鑒別、遺傳多樣性分析、親緣關系分析等研究領域得到了廣泛應用。

雖然基于隨機引物PCR的分子標記技術顯示出了它獨特的優越性，但目前尚未發現任何一種分子標記技術可以滿足作為理想的遺傳標記的所有要求。因此在實驗過程中我們往往需要結合其他分子標記，使之可以快速構建高飽和度的遺傳圖譜。不過可以預見的是基于隨機引物PCR的分子標記技術將在一定時期內得到長足發展，有一個更廣闊的應用前景。

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