雷公藤紅素增強多柔比星抑制肝癌細胞系Huh7細胞活性的實驗研究

丁成國

雷公藤紅素增強多柔比星抑制肝癌細胞系Huh7細胞活性的實驗研究

丁成國

目的 觀察雷公藤紅素增強多柔比星對肝癌細胞的殺傷活性及機制。方法 設0.5、1、2μmol/L濃度的雷公藤紅素為雷公藤紅素1、2、3組，設0.1、1g/mL濃度的多柔比星為多柔比星1、2組；MTT法檢測多柔比星單獨治療及聯合雷公藤紅素治療對肝癌細胞系Huh7的殺傷活性。熒光定量PCR方法檢測人正常胎肝細胞系L-O2及肝癌細胞系Huh7、HepG2和PLC的PKM2表達水平。MTT法檢測PKM2表達載體轉染對雷公藤紅素聯合多柔比星殺傷Huh7細胞療效的影響。結果與對照組Huh7細胞活力零抑制率比較，雷公藤紅素1、2、3組分別為（2.6±0.9）%、（4.7±1.3）%（P均<0.05）、（8.8±1.9）%（P<0.05）；多柔比星1、2組分別為（7.5±1.9）%、（61.4±4.2）%（P均<0.05）；1μmol/L雷公藤紅素聯合0.1、1g/mL多柔比星較多柔比星1、2組，Huh7細胞活力抑制率明顯上升[（58.7±3.8）%比（7.5±1.9）%，P<0.05；（89.7±6.7）%比（61.4±4.2）%，P<0.05]。PKM2相對表達水平，相對人正常肝細胞系L-O2細胞系的（1.0±0.05），Huh7細胞系為（15.2±0.6）（P<0.05），HepG2細胞系為（11.8±0.5）（P<0.05），PLC細胞系為（13.4±0.7）（P<0.05）；雷公藤紅素1、2、3組分別下調為（0.70± 0.05）（P<0.05）、（0.42±0.04）（P<0.05）、（0.31±0.03）（P<0.05）；多柔比星組無下調作用；1μmol/L雷公藤紅素聯合0.1、1g/mL多柔比星后PKM2相對表達水平較多柔比星1、2組明顯下降 [（0.44±0.04）比（0.98±0.07），P<0.05；（0.41±0.03）比（1.01±0.07），P<0.05]。轉染PKM2表達載體后，1μmol/L雷公藤紅素聯合0.1、1g/mL多柔比星對Huh7細胞活力抑制率較未轉染組下降 [（60.5±4.3）%比（19.3± 2.0）%，P<0.05；（91.6±6.9）%比（69.6±4.5）%，P<0.05]。結論 雷公藤紅素通過下調PKM2的表達抑制腫瘤細胞的糖代謝，增強多柔比星對肝癌細胞系Huh7的殺傷活性。

肝癌細胞系；Huh7；雷公藤紅素；PKM2；糖代謝；多柔比星

肝癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤之一，其致死率居惡性腫瘤第三位[1]。多柔比星是一種抗腫瘤抗生素，通過抑制腫瘤細胞DNA/RNA的生物合成起到殺傷腫瘤細胞的目的。多柔比星是治療肝癌的常規化療藥物，但腫瘤細胞的藥物抵抗制約了多柔比星的臨床應用[2]。因此，尋找其他的藥物與多柔比星進行聯合用藥以增強多柔比星的抗腫瘤活性是目前腫瘤治療研究的重點。據報道，雷公藤紅素有一定的抗腫瘤活性[3-4]。本研究探討雷公藤紅素是否能增強多柔比星對肝癌細胞的殺傷活性，并研究其具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞系Huh7、HepG2、PLC及人正常肝細胞系L-O2購于上海中科院生物化學與細胞生物學研究所。所有細胞系培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，并將細胞置于37°C恒溫培養箱中培養，通入5%CO2。

1.2 材 料 多柔比星、噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、雷公藤紅素購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養基購于美國Gibco。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、pcDNA3.1（plasmid complementory DNA 3.1，真核表達載體）、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。葡萄糖檢測試劑盒（Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase assay kit）購于美國Molecular Probes公司，乳酸檢測試劑盒（Lactate assay kit）購于美國BioVision公司。SYBR Green試劑購于日本 TaKaRa。PKM2（pyruvate kinase M2，丙酮酸激酶M2）和GAPDH（內參）PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：PKM2上游：5’-GCCTGGCGCCCATTACCA-3’，下游：5’-CCCACTGCAGCACTTGAAG-3’；GAPDH上游：5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′，GAPDH下游：5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。

1.3 實驗分組 設0.5、1、2μmol/L濃度的雷公藤紅素為雷公藤1、2、3組，設0.1、1g/mL濃度的多柔比星為多柔比星1、2組。對照組不加藥物。

1.4 熒光定量PCR檢測PKM2的表達 所有細胞的總RNA用Trizol試劑提取，之后用逆轉錄試劑盒按照說明書步驟進行cDNA的合成。以該cDNA為模板，在PCR體系中加入PKM2或GAPDH的引物，再加入SYBR Green試劑，按照SYBR Green操作說明書步驟進行PKM2基因的定量PCR實驗，PKM2的相對表達由2-△△CT法計算[5]。

1.5 Huh7細胞葡萄糖的攝取及乳酸的檢測 用葡萄糖檢測試劑盒檢測DMEM培養基中的葡萄糖濃度，用C0表示。將Huh7細胞按1×104/孔接種在96孔板上，加入200μL DMEM培養基，在培養基中加入雷公藤紅素及多柔比星處理2h（對照組不加藥物處理2h），按照試劑盒說明書步驟檢測培養基中的葡萄糖濃度，用C表示，則各組葡萄糖絕對攝取量ΔC= C0-C。葡萄糖的相對攝取量用以下公式計算：葡萄糖相對攝取量=（ΔC對照組-ΔC治療組）/ΔC對照組。乳酸的相對生成量檢測步驟及計算方法與葡萄糖相同。

1.6 質粒構建及轉染 將PKM2基因的開放閱讀框架全序列（Gene ID：NM-001206796）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成pcDNA3.1-PKM2重組真核表達質粒[6]，質粒的轉染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟進行，將pcDNA3.1-PKM2（2μg/mL）轉染入Huh7細胞中，培養24h。

1.7 MTT法檢測藥物對腫瘤細胞殺傷活性 將Huh7細胞按 5×103/孔接種在 96孔板上。將pcDNA3.1-PKM2（2μg/mL）轉染入Huh7細胞中，孵育24h。然后再加入雷公藤紅素，及多柔比星培養48h。之后加5mg/mLMTT 20μL繼續培養4h。棄上清，在570nmol/L波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。

2 結果

2.1 雷公藤紅素提高多柔比星對Huh7細胞的殺傷活性 雷公藤紅素單治療對Huh7的殺傷活性較弱，見表1。1μmol/L雷公藤紅素聯合多柔比星治療，可顯著提高多柔比星對Huh7細胞的殺傷活性，見表2。

2.2 肝癌細胞系高表達PKM2 三種肝癌細胞系Huh7、HepG2和 PLC的 PKM2表達水平分別為（15.2±0.6）、（11.8±0.5）、（13.4±0.7），均顯著高于正常肝細胞系L-O2的（1.0±0.05），差異有統計學意義（P<0.05）。

表1 雷公藤紅素對Huh7細胞的抑制作用（±s）

表1 雷公藤紅素對Huh7細胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

對照組雷公藤紅素1組雷公藤紅素2組雷公藤紅素3組3333 0 0.5 12 0 2.6±0.9 4.7±1.3* 8.8±1.9*

2.3 雷公藤紅素顯著下調Huh7細胞PKM2的表達水平并抑制其糖代謝 雷公藤紅素能顯著下調Huh7細胞PKM2的表達水平并抑制其葡萄糖的攝取和乳酸的生成，而多柔比星則對PKM2表達水平及糖代謝無影響。見表3。

表2 各組Huh7細胞抑制作用比較（±s）

表2 各組Huh7細胞抑制作用比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與多柔比星1組比較；#P<0.05；與多柔比星2組比較，△P<0.05

孔數 雷公藤紅素濃度（μmol/L） 多柔比星濃度（μg/mL）組別對照組雷公藤紅素組多柔比星1組多柔比星2組雷公藤紅素+多柔比星1組雷公藤紅素+多柔比星2組333333 010011 00 0.1 1 0.1 1細胞活力抑制率（%）0 4.7±1.3 7.5±1.9* 61.4±4.2* 58.7±3.8*#89.7±6.7*△

表3 各組Huh7細胞PKM2表達及糖代謝比較（±s）

表3 各組Huh7細胞PKM2表達及糖代謝比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與多柔比星1組比較，#P<0.05；與多柔比星2組比較，△P<0.05；PKM2：丙酮酸激酶M2

組別對照組雷公藤紅素1組雷公藤紅素2組雷公藤紅素3組多柔比星1組多柔比星1組雷公藤紅素2組+多柔比星1組雷公藤紅素2組+多柔比星2組孔數33333333雷公藤紅素濃度（μmol/L）0 0.5多柔比星濃度（μg/mL）120011 0000 0.1 1 0.1 1 PKM2相對表達水平1.0±0.03 0.70±0.05* 0.42±0.04* 0.31±0.03* 0.98±0.07 1.01±0.07 0.44±0.04*#0.41±0.03*△葡萄糖相對攝取量1.0±0.05 0.85±0.05* 0.69±0.04* 0.63±0.04* 1.02±0.06 0.99±0.06 0.71±0.05*#0.68±0.06*△乳酸相對生成量1.0±0.06 0.86±0.06* 0.61±0.05* 0.52±0.04* 0.98±0.05 1.02±0.07 0.63±0.06*#0.60±0.05*△

表4 雷公藤紅素對Huh7細胞PKM2表達及糖代謝的影響（±s）

表4 雷公藤紅素對Huh7細胞PKM2表達及糖代謝的影響（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星1組比較，#P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星2組比較，△P<0.05；pcDNA3.1：真核表達載體

組別對照組多柔比星1組多柔比星2組多柔比星1組+pcDNA3.1-PKM2組多柔比星2組+pcDNA3.1-PKM2組雷公藤紅素+多柔比星1組雷公藤紅素+多柔比星2組雷公藤紅素+多柔比星1組+pcDNA3.1-PKM2組雷公藤紅素+多柔比星2組+pcDNA3.1-PKM2組孔數 雷公藤紅素濃度（μmol/L）pcDNA3.1-PKM2（μg/mL）333333333 000001111多柔比星濃度（μg/mL）0 0.1 1 0.1 1 0.1 1 0.1 1 000220022細胞活力抑制率（%）0 7.7±0.06* 60.6±3.8* 8.2±0.07* 62.4±4.1* 60.5±4.3* 91.6±6.9* 19.3±2.0*#69.6±4.5*△

2.4 過表達PKM2顯著抑制雷公藤紅素對多柔比星抗腫瘤作用的協同效應 體外轉染PKM2表達載體對多柔比星單治療組的細胞活力抑制率無影響，但過表達PKM2能顯著抑制雷公藤紅素對多柔比星抗腫瘤作用的協同效應，見表4。

3 討論

雷公藤紅素是一種具有多種生物活性的三萜類化合物，來源于中藥雷公藤的根皮，目前臨床上主要用于治療類風濕性疾病[7]。最近的研究發現，雷公藤紅素還具有一定的抗腫瘤效應，如雷公藤紅素在體外能抑制前列腺癌細胞的增殖[3]，還能通過激活JNK/ ATF2途徑增強順鉑對非小細胞肺癌的抗腫瘤活性[4]。在本研究中，筆者同樣發現雷公藤紅素單獨治療有微弱的抗肝癌細胞的生物活性，而更為重要的是，雷公藤紅素還能顯著提高化療藥物多柔比星對肝癌細胞的治療效果。

腫瘤細胞的一個重要特征是其與正常細胞相比，它們的糖代謝異常旺盛。腫瘤細胞能攝取更多的葡萄糖，但大部分葡萄糖卻不進入氧化磷酸化釋放能量，反而進行有氧糖酵解合成更多的中間產物，最后生成乳酸，而這些中間產物往往是合成核酸和蛋白質的原料[8]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是有氧糖酵解過程中的關鍵酶，腫瘤細胞PKM2往往異常高表達以促進有氧糖酵解的進行[9-10]。有文獻[11-12]報道，腫瘤細胞的化療藥物耐藥和腫瘤細胞的糖代謝異常有關，本研究進一步研究雷公藤紅素對多柔比星的協同效應是否和腫瘤細胞的糖代謝有關。

本實驗研究發現，與正常肝細胞系相比，肝腫瘤細胞系的PKM2水平顯著高表達，表明腫瘤的發生可能和PKM2的異常表達有關。進一步研究發現雷公藤紅素能顯著降低Huh7細胞的PKM2表達水平，并減弱Huh7細胞對葡萄糖的攝取和乳酸的生成，表明雷公藤紅素能顯著抑制肝癌細胞的糖代謝和有氧糖酵解。為證實雷公藤紅素增強多柔比星殺傷活性依賴于PKM2的下調，我們構建了PKM2重組表達質粒，使PKM2在Huh7細胞中過表達。發現當Huh7細胞中PKM2發生過表達后，雷公藤紅素對多柔比星的協同抗肝癌作用受到顯著抑制，同時，PKM2的過表達不影響多柔比星單治療組對Huh7的殺傷活性。這些結果證實雷公藤紅素增強多柔比星抗腫瘤效應的機制是靶向于PKM2基因。

本研究顯示，雷公藤紅素具有化療藥物增效的作用，其分子機制可能為通過下調PKM2的表達抑制腫瘤細胞的糖代謝以增強化療藥物對肝癌細胞的殺傷活性。這些實驗結果為雷公藤紅素與化療藥物的聯合治療方案提供了理論依據。

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（收稿：2015-06-12 修回：2015-07-10）

Celastrol Enhances the Cytotoxicity of Doxorubicin via Inhibiting the G lucose M etabolism in Hepatocellular Carcinoma Cell Line Huh7

DING Chengguo.Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of celastrol on doxorubicin therapy in hepatocellular carcinoma（HCC）in vitro.M ethods HCC cell line Huh7 cells were treated with celastrol alone at 0.5,1,2μmol/L or doxorubicin alone at concentration of 0.1 and 1g/mL or the combination of celastrol（1μmol/L）and doxorubicin（0.1 and 1g/mL）.MTT assay was performed to determine the viability inhibition of doxorubicin plus celastrolon Huh7 cells.RT-qPCR analysis was performed to detect the expression of PKM2 in normal liver cell line L-O2 and HCC cell lines Huh7,HepG2,and PLC.PKM2 expression vector was constructed and then transfected into Huh7 cells treated with celastrol plus doxorubicin.The effect of PKM2 vectors on celastrol plus doxorubicin therapy was detected by MTT assay.Results The Huh7 cell viability inhibition rate was 2.6%±0.9%in 0.5μmol/L celastrol group,4.7%±1.3%in 1μmol/L celastrol group,8.8%±1.9%in 2μmol/L celastrol group;7.5%±1.9%in 0.1μg/mL doxorubicin single group,61.4%±4.2%in 1μg/mL doxorubicin single group,all with a significant difference to that of control group（all P<0.05）.Compared with doxorubicin single group,the cell viability inhibition rate increased to 58.7%±3.8%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group and 89.7%±6.7%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin group（P<0.05）.The relative expression of PKM2 was as follows:1.0±0.05 on L-O2,15.2±0.6 on Huh7,11.8±0.5 on HepG2,and 13.4±0.7 on PLC（P<0.05）.Celastrol decreased the expression of PKM2 on Huh7（0.70±0.05）,HepG2（0.42±0.04）,and PLC（0.31±0.03）cells（P<0.05）.No effect was observed in doxorubicin single groups,but the expressions of PKM2 in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group and 1μmol/L celastrol+1μg/ mL doxorubicin group were lower than those of doxorubicin single group（0.44±0.04 vs 0.98±0.07;0.41±0.03 vs 1.01±0.07;all P<0.05）.The synergism of celastrol to doxorubicin was inhibited after the transfection of PKM2,and the cell viability inhibition rate was as follows:60.5%±4.3%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group, 91.6%±6.9%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin group,19.3%±2.0%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin+pcDNA3.1-PKM2group,69.6%±4.5%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin+pcDNA3.1-PKM2 group（P< 0.05）.Conclusion Celastrol enhances the cytotoxicity of doxorubicin via inhibiting the glucose metabolism in HCC cell line Huh7.This may relate to the downregulation of PKM2 in Huh7 cells.

hepatocellular carcinoma cell line;Huh7;celastrol;PKM2;glucose metabolism;doxorubicin

杭州市第一人民醫院檢驗科（杭州 310006）