PTEN和FHIT在結直腸癌組織的表達和意義

朱 艷 葛偉林

PTEN和FHIT在結直腸癌組織的表達和意義

朱 艷 葛偉林

目的 研究磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）和脆性三聯組氨酸（FHIT）的表達與結直腸癌（CRC）臨床病理參數之間的關系。方法 102例CRC組織標本，取53例癌旁組織正常結直腸黏膜做對照，采用免疫組織化學S-P法檢測PTEN和FHIT蛋白在CRC組織、正常組織中的表達情況，分析PTEN和FHIT的表達與CRC的相關性。結果 ①PTEN在CRC組織和正常組織中表達的陽性率分別為40.2%（41/102）和84.9%（45/53），兩者差異具有統計學意義（P＜0.01）；FHIT在CRC組織和正常組織中表達的陽性率分別為44.1%（45/102）和92.5%（49/53），差異有統計學意義（P＜0.01）；②PTEN和FHIT的表達與性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關性（P＞0.05），與Dukes分期、分化程度和淋巴結轉移相關（P＜0.01），PTEN的表達與腫瘤部位無關，FHIT的表達與腫瘤部位相關（P＜0.05）；③Spearman等級相關分析提示，PTEN和FHIT在CRC組織間的表達呈正相關（r=0.616，P＜0.01）。結論 PTEN和FHIT參與了CRC的發生發展過程，兩者聯合檢測對于評估CRC的生物學特性和判斷預后具有一定價值。

結直腸癌；磷酸酯酶與張力蛋白同源物；脆性三聯組氨酸

原癌基因的激活與抑癌基因的失活是腫瘤發生過程中重要的分子事件。磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和脆性三聯組氨酸（fragile histidine triad，FHIT）都被認為是重要的抑癌基因，其缺失和突變常導致腫瘤的發生[1-2]。

本研究通過免疫組織化學方法聯合檢測結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）組織PTEN和FHIT蛋白的表達以及與CRC的臨床病理參數之間的關系，分析二者之間表達的相關性，以期為CRC的發生機制提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料 收集本院外科2007年2月—2013年行結直腸癌根治手術并具有完整臨床數據的病理標本102例，并取53例距離腫瘤組織8cm以上的癌旁正常組織為對照，所有患者術前均未接受化療、靶向治療和放療。其中男63例，女39例；年齡34～77歲，平均年齡52.5歲。左半結腸癌22例，橫結腸癌9例，右半結腸癌20例，乙狀結腸癌17例，直腸癌34例。Dukes分期：A期17例，B期33例，C1期19例，C2期15例，D期18例；組織學分型：高分化15例，中分化24，低分化55例，未分化8例。對照標本經HE染色鏡下未見腫瘤細胞。

1.2 試劑和方法 一抗鼠抗人PTEN單克隆抗體和兔抗人FHIT單克隆抗體試劑盒均購自福州邁新公司。二抗及免疫組化試劑盒購自北京中杉生物科技公司。所有標本均以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，每例蠟塊以4μm厚度連續切片，用于免疫組化染色。應用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，操作步驟按試劑盒提示進行，切片經處理后進行HE染色和免疫組化染色。PTEN的工作濃度為1:200，FHIT的工作濃度為1:150。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，用已知的PTEN和FHIT陽性的胃癌切片作陽性對照。

1.3 結果判定 由兩名病理專家閱片，根據PTEN和FHIT在腫瘤細胞中出現棕黃色或棕褐色染色判定為陽性。PTEN蛋白染色多位于細胞質，癌巢中心染色較強，為棕黃色顆粒狀。FHIT蛋白染色多位于細胞質，部分表達于細胞膜，為黃色或棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野（×400），根據陽性細胞百分率及顯色深淺進行分類判斷。其中染色強度0：無染色；1：淡黃色；2：棕黃色；3：棕褐色。后按陽性細胞所占百分比記分：＜5%為0分，5%~ 25%為1分，25%~50%為2分，50%~75%為3分，＞75%為4分；根據兩項積分之和為每張切片組織染色結果，＞3分記為陽性，≤3分記為陰性。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，PTEN和FHIT表達相關性采用spearman相關分析方法，取P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN蛋白在CRC組織和正常組織表達 102例CRC中PTEN蛋白呈陽性表達41例，表達率40.2%；53例正常組織中PTEN蛋白陽性表達45例，表達率84.9%。PTEN在正常組織中表達高于CRC組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1

2.2 FHIT蛋白在CRC組織和正常組織表達 102例CRC中FHIT蛋白45例呈陽性表達，表達率44.1%；53例正常組織中陽性表達49例，表達率92.5%。FHIT在正常組織中表達高于CRC組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 PTEN和FHIT蛋白在CRC和正常黏膜表達（例）

2.3 PTEN和FHIT蛋白表達與CRC的臨床病理參數的關系 PTEN與FHIT的表達與性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關性（P＞0.05），而Dukes分期較晚、分化程度低和淋巴結轉移者，兩者表達呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。結腸癌患者FHIT的表達高于直腸癌患者而PTEN表達與癌灶部位無關。見表2。

表2 PTEN和FHIT蛋白表達與CRC的臨床病理參數（例）

2.4 PTEN和FHIT相關性 在102例結直腸癌組織中，PTEN和FHIT表達均為陽性38例，均為陰性54例；PTEN表達陽性而FHIT表達陰性3例；PTEN表達陰性而FHIT表達陽性7例；采用spearman等級相關分析結果顯示，PTEN與FHIT蛋白在結直腸癌組織表達呈正相關（r=0.616，P＜0.01）。見表3。

表3 PTEN和FHIT的相關性（例）

3 討論

結直腸癌的發生是一個多因素、多階段、多步驟綜合作用的結果，其發生發展的分子機制仍未闡明。目前認為，PTEN和FHIT蛋白的表達異常與CRC的發生和發展有關，但PTEN和FHIT與CRC的關系存在爭議。

PTEN基因由Li等在1997年首次發現，它定位于10q23.3，全長200kb，轉錄產物為515kb mRNA，其蛋白產物含有一酪蛋白磷酸酶的功能區和約175個氨基酸左右的與骨架蛋白tenasin、auxilin同源的區域，是迄今發現第一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因[1]。它可能通過阻斷酪氨酸蛋白激酶來抑制腫瘤細胞生長，抑制細胞由G1期進入S期，并調節腫瘤細胞的侵襲和轉移。PTEN由于基因突變、缺失、甲基化等過程使mRNA和蛋白表達降低，從而導致腫瘤的發生。PTEN在人類消化道腫瘤、腎癌、乳腺癌中均存在表達缺失，被認為與腫瘤的惡性程度呈正相關，其低表達則預示患者預后不良[3-5]。Sawai等[6]通過比較PTEN在伴有和不伴有肝轉移的CRC組織表達，發現前者75.4%呈弱表達，在肝轉移組織中表達缺失，后者62.9%呈強陽性表達，且發現PTEN陽性表達患者的5年生存率顯著高于陰性表達患者。本研究證實，PTEN在CRC中出現特異性表達缺失，這與大多數研究結果相符。進一步發現在Dukes分期C-D期、結腸癌細胞低分化和未分化以及伴有淋巴結轉移的患者，PTEN的表達均較病理分期早、細胞分化好、無淋巴結轉移的患者低，提示該基因的缺失在誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞浸潤和轉移方面有著重要作用。

FHIT基因是一種抑癌基因，定位于3p14.2區域，由10個外顯子組成，編碼的FHIT蛋白由147個氨基酸殘基組成，分子量為16 800，表達于人體多種器官如心、肝、腎以及消化道組織中[2]。FHIT的失活已有研究表明，FHIT表達的缺失見于胃癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌和肝癌等組織中，并與腫瘤的發生、侵襲、轉移和預后相關。Nan等[7]通過免疫組化和TUNEL法檢測了47例原發性肝細胞癌組織中FHIT和PCNA的表達，發現所有正常肝臟組織中均高表達FHIT，而59.6%肝癌組織中表達缺失，且FHIT的表達與病理分期和有無轉移密切相關，提示FHIT在肝細胞癌的發生和發展中起重要作用。但也有研究通過FHITmRNA的定量分析后發現，在86%的CRC和60%的腺瘤組織中都檢測到高水平表達，與免疫組化結果相吻合；且FHIT蛋白在Dukes’C/D期和N1/N2淋巴結轉移的CRC組織中亦呈高表達[8]。本研究發現，FHIT蛋白在正常組織表達高于CRC組織，推測FHIT蛋白可能是結直腸組織正常生長的必要因素之一；通過分析發現FHIT蛋白表達與CRC病理分期和組織分化程度關系密切，且在結腸癌和直腸癌中的表達存在差異，提示FHIT在結腸癌和直腸癌發生發展中可能存在不同的作用機制，有待進一步研究。有學者[9]通過組織微陣列（TMA）和TUNEL方法對CRC中FHIT、Bax、Bcl-2和Survivin基因進行檢測，發現FHIT基因突變導致其表達下調，同時伴有抗凋亡基因Bcl-2和Survivin表達的上調和凋亡基因Bax的下調。提示FHIT的突變可能通過以上途徑促進正常結直腸黏膜向癌組織的轉變。

Zheng等[10]通過含有正常胃黏膜、腺瘤、胃癌組織的組織微陣列檢測了PTEN和FHIT的表達，發現PTEN和FHIT雙陽性患者預后相對較好，而且在胃癌組織中的表達呈正相關，并提示PTEN和FHIT的下調可能打破了細胞凋亡和增殖平衡，而促進癌變的發生。已有文獻對PTEN和FHIT蛋白在結直腸癌組織中表達的相關性研究較少。本研究顯示，結直腸癌組織中PTEN和FHIT蛋白的表達呈正相關，兩個基因常存在同時失活現象，具體協同機制有待于今后進一步研究。

本研究通過免疫組化方法聯合檢測PTEN和FHIT在結直腸癌組織和正常結直腸組織中表達的差異，初步證實PTEN和FHIT參與了結直腸癌的發生發展過程。因此，聯合檢測結直腸癌組織中PTEN和FHIT蛋白的表達可為結直腸癌的侵襲和轉移能力提供參考價值，并對判斷結直腸癌患者的預后具有重要意義。

［1］Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，andprostate cancer［J］.Science，1997，275（5308）：1943-1947.

［2］Croce CM，Sozzi G，Huebner K.Role of FHIT in human cancer［J］.JClin Oncol，1999，17（5）：1618-1624.

［3］Zou TT，Lei J，Shi YQ，et al.FHIT gene alterations in esophageal cancer and ulcerative colitis（UC）［J］.Oncogene，1997，15（1）：101-105.

［4］ Campiglio M，Pekarsky Y，Menard S，et al.FHIT loss of function in human primary breast cancer correlates with advanced stage of the disease［J］.Cancer Res，1999，59（16）：3866-3869.

［5］袁禧先，張丹，王鳳榮，等.基質金屬蛋白酶-9與抑癌基因PTEN在大腸腺瘤、大腸癌組織中的表達及意義［J］.世界華人消化雜志，2008，16（10）：1132-1136.

［6］Sawai H，Yasuda A，Ochi N，et al.Loss of PTEN expression is associated with colorectal cancer liver metastasis and poor patient survival［J］.BMCGastroenterol，2008，8：56-62.

［7］Nan KJ，Ruan ZP，Jing Z，etal.Expression of fragile histi dine triad in primary hepatocellular carcinoma and its relation with cell proliferation and apoptosis［J］.World JGastroenterol，2005，11（2）：228-231.

［8］Wierzbicki PM，Adrych K，Kartanowicz D，et al.Fragile histidine triad（FHIT）gene is overexpressed in colorectal cancer［J］.JPhysiol Pharmacol，2009，60（Suppl 4）：63-70.

［9］Cao J，Li W，Xie J，et al.Down-regulation of FHIT inhibits apoptosis of colorectal cancer:mechanism and clinical implication［J］.Surg Oncol，2006，15（4）：223-233.

［10］Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas：tissue-array findings［J］.Appl Immunohistochem MolMorphol，2007，15（4）：432-440.

（收稿：2014-09-21 修回：2014-11-07）

Expressions of PTEN and FHIT in Colorectal Carcinoma and Their Clinical Pathological Significance

ZHU Yan,GE Weilin. Department of Surgery,Xiangshan County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangshan (315711),China

Objective To investigate the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）and fragile histidine triad（FHIT）in colorectal cancer（CRC）and their relationship to clinical pathology of colorectal cancer.M ethods One hundred and 2 CRC specimens were collected and 53 specimens of adjacent normal mucosa tissues served as control.PTEN and FHIT expressions in CRC specimens and controls were detected by S-P method and their relationship with CRC was evaluated.Results The positive rate ofPTEN in CRC specimens and controls were 40.2%（41/102）and 84.9%（45/53）,and the expressions of FHIT were 44.1%（45/102）and 92.5%（49/53）,respectively,both with a significant difference（all P<0.01）.Both of PTEN and FHIT were related to Dukes stages and tumor pTNM classification（P<0.01）,but not related to gender,age,and size of the tumor（P>0.05）;PTEN was not related to the location of the tumor but FHIT was（P<0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that PTEN was correlated with FHIT in CRC tissues（r=0.616,P<0.01）.Conclusion PTEN and FHIT were involved in the development and progress of CRC.To evaluate the expression of both proteins may be valuable for the study of biological features and prognosis of CRC.

colorectal carcinoma;phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）;fragile histidine triad（FHIT）

浙江省象山縣中醫院外科（象山 315711）

朱艷，Tel：18268892660；E-mial：zhuyanxs@sina.com