蛋白激酶Cα參與高糖致人系膜細胞癌胚纖維連接蛋白的表達

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蛋白激酶Cα參與高糖致人系膜細胞癌胚纖維連接蛋白的表達

杜超1，蔣智1，熊勤攀1，周波2

(1.岳池縣人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川岳池638300; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶400016 )

【摘要】目的:研究高糖環(huán)境下人系膜細胞(HMC)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)、癌胚纖維連接蛋白(oncofetal FN)表達水平，并進一步探討PKCα與oncofetal FN mRNA之間的關(guān)系。方法:實驗HMC分組如下:正常葡萄糖組(NG，5 mmol/L D-葡萄糖)，滲透壓對照組(LG，5 mmol/L D-葡萄糖+ 20 mmol/L L-葡萄糖)，高葡萄糖組(HG，25 mmol/L D-葡萄糖)，高葡萄糖+ PKCα抑制劑組(HS，25 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L Safingol)。以激光共聚焦顯微鏡觀察PKCα蛋白表達及轉(zhuǎn)位，RT-PCR法檢測oncofetal FN mRNA表達水平。結(jié)果: (1)與NG組對比，高葡萄糖可促進蛋白激酶Cα蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，定量分析示HG組胞漿/胞核強度較NG組降低20％(P＜0.05)，高葡萄糖刺激誘導(dǎo)HMC oncofetal FN mRNA上調(diào)，為NG組的2.36倍(P＜0.05)。(2)與HG組比較，HS組PKCα蛋白轉(zhuǎn)位激活被抑制，胞漿/胞核熒光強度比值為HG組的1.15倍，HS組oncofetal FN mRNA表達較HG組降低45％(P值均＜0.05)。結(jié)論: PKCα的激活參與高葡萄糖致人系膜細胞oncofetal FN的表達。

【關(guān)鍵詞】蛋白激酶Cα;癌胚纖維連接蛋白;高糖;系膜細胞

腎臟系糖尿病血管并發(fā)癥的主要靶器官之一，高糖可促進腎臟細胞外基質(zhì)聚集，其中，纖維連接蛋白(FN)是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的基本成分，癌胚纖維連接蛋白(oncofetal FN)被認為是新合成FN的重要標(biāo)記［1-2］。高糖可誘導(dǎo)蛋白激酶Cα(PKCα)轉(zhuǎn)位激活，促進炎癥因子、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生而加重腎臟的損傷。然而，PKCα是否參與調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下oncofetal FN的表達尚不清楚，因此，本實驗以體外培養(yǎng)人系膜細胞為模型，觀察高糖對系膜細胞PKCα和oncofetal FN表達的影響，并探討PKCα在其中的作用，以期為闡明糖尿病腎病發(fā)病機制和臨床防治提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

HMC由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈。D-葡萄糖購(Bio Basic公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)，PKCα特異性抑制劑Asfingol(sigma公司)，RT-PCR相關(guān)試劑盒(大連寶生物公司)，兔抗人PKCα多抗、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(Santa Cruz公司)。PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，激光共聚焦顯微鏡(MD公司)。

1.2人系膜細胞培養(yǎng)與分組

HMCs培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(37℃、5％ CO2)，分組如下: (1)正常葡萄糖組(NG，5 mmol/L D-葡萄糖)，(2)滲透壓對照組(LG，5 mmol/L D-葡萄糖+20 mmol/L L-葡萄糖)，(3)高葡萄糖組(HG，25 mmol/L D-葡萄糖)，(4)高葡萄糖+ PKCα抑制劑組(HS，25 mmol/L D-葡萄糖+ 40 μmol/L Safingol)，共培養(yǎng)2 d。

1.3激光共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測PKCα蛋白表達及轉(zhuǎn)位

分組細胞經(jīng)固定、打孔、封閉、孵育抗體、封片，激光共聚焦顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件行熒光強度分析。具體方法參見本實驗室既往研究報道［3］。

1.4RT-PCR法檢測oncofetal FNmRNA表達

提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步PCR反應(yīng)。oncofetal FN引物序列見參考文獻［3］，P1∶5'CCGCCATTAATGAGAGTGAT 3'，P2∶5' AGTTAGTTGCGGCAGGAGAAG 3'，產(chǎn)物長度133 bp，內(nèi)參β-actin引物序列見參考文獻［3］，P1∶5'CCATGTACGTTGCTATCCAGG 3'，P2∶5' TCTCCTTAATGTCACGCACGA 3'，產(chǎn)物長度252 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)4％瓊脂糖凝膠電泳后照相，Quantity One軟件分析圖像，以oncofetal FN與β-actin光密度值之比反應(yīng)oncofetal FN的相對表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1高糖對人系膜細胞PKCα表達的影響

LSCM觀察NG組PKCα主要分布于細胞質(zhì)中，胞核表達弱，LG組與NG組相似，HG組胞質(zhì)、胞核內(nèi)均見熒光分布，且PKCα呈胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位(圖1);定量分析示HG組細胞核平均熒光強度為NG組的1.32倍，胞質(zhì)/胞核熒光強度比值較NG組下降20％ (P值均＜0.05，見表1)，提示高糖促進PKCα核轉(zhuǎn)位，而高滲透無此效應(yīng)。

圖1　激光共聚焦顯微鏡觀察各組人系膜細胞細胞PKCα蛋白表達（×800）

2.2高糖對人系膜細胞oncofetal FN mRNA表達的影響

RT-PCR顯示NG組、LG組oncofetal FN條帶較淡，HG組條帶明亮，半定量顯示HG組oncofetal FN mRNA為NG組的2.36倍(P值＜0.05，見圖2，表2)。

圖2　各分組人系膜細胞癌胚型纖維連接蛋白（oncofetal FN mRNA）表達

2.3PKCα抑制劑對高糖作用下人系膜細胞onco-fetal FN mRNA表達的影響

與HG組比較，HS組PKCα胞核表達較弱，定量分析示胞質(zhì)/胞核熒光強度比值較HG組增加15％(P值均＜0.05，見圖1，表1);與HG組比較，HS組oncofetal FN mRNA為HG組的55％ (P值＜0.05，見圖2，表2)。

表1　各組人系膜細胞MR平均熒光強度(±s，n =3)

表1　各組人系膜細胞MR平均熒光強度(±s，n =3)

* P＜0.05，與NG組比較; #P＜0.05，與HG組比較。

組別　　胞質(zhì)　　胞核　　胞質(zhì)/胞核NG組29.657±4.256　12.086±1.861　2.454±0.126 LG組　30.482±2.854　12.847±1.569　2.373±0.164 HG組　31.581±3.763　16.026±1.824*　1.971±0.098*HS組　30.495±4.328　13.429±1.456#　2.271±0.114#

表2　各組人系膜細胞oncoFNmRNA表達水平(±s)

表2　各組人系膜細胞oncoFNmRNA表達水平(±s)

* P＜0.05，與NG組比較; #P＜0.05，與HG組比較。

組別　oncofetal FNmRNA 相對表達量NG組0.247±0.012 LG組　0.253±0.011 HG組　0.584±0.042*HS組　0.321±0.016#

3　討論

蛋白激酶C是一類Ca2 +和磷脂依賴性蛋白，具有多種亞型，其在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色［4-5］。研究表明，高血糖可激活蛋白激酶C而促進糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展［6-7］。PKCα是蛋白激酶C的亞型之一，廣泛存在于腎臟系膜細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞中，在本實驗中，PKCα在正常葡萄糖濃度時主要分布在系膜細胞胞漿內(nèi)，胞核表達很少，在高濃度葡萄糖時胞核表達增強，胞漿減弱，表明PKCα在高糖環(huán)境存在核轉(zhuǎn)位激活效應(yīng)，此與萬沁等［8］學(xué)者的研究結(jié)果一致，進入胞核的PKCα可增加細胞外基質(zhì)的聚集而介導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展［9］。

oncofetal FN現(xiàn)被認為是反映新合成細胞外基質(zhì)的主要標(biāo)記，研究表明高糖環(huán)境誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞oncofetal FN的表達上調(diào)［10］，而本課題組既往的研究表明高糖增加系膜細胞oncofetal FN的表達水平［3，11］，本次研究再次證實上述結(jié)果，此與Khan等［12］的研究結(jié)果相似。高糖可通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和結(jié)締組織生長因子的表達誘導(dǎo)纖維連接蛋白的合成而促進細胞外基質(zhì)的聚集，肖瑛等［9］研究進一步證實PKCα參與調(diào)節(jié)這一效應(yīng)。然而，高糖環(huán)境下PKCα與oncofetal FN之間的關(guān)系尚無相關(guān)研究。本研究通過采用PKCα特異性抑制劑，觀察到阻斷PKCα轉(zhuǎn)位激活效應(yīng)可影響高糖環(huán)境下oncofetal FN表達水平，但具體作用機制不清，可能系PKCα抑制TGF-β表達，從而下調(diào)oncofetal FN表達水平有關(guān)［13］，尚需進一步研究證實。

本研究通過在體外建立高糖環(huán)境對人系膜細胞的損傷模型，證實高糖誘導(dǎo)系膜細胞PKCα轉(zhuǎn)位激活效應(yīng)，并增加系膜細胞oncofetal FN mRNA的表達，而PKCα抑制劑顯著降低高糖對系膜細胞oncofetal FN mRNA的作用。表明PKCα可能參與調(diào)節(jié)高糖下系膜細胞oncofetal FN的表達，進而影響細胞外基質(zhì)聚集，其為糖尿病腎病的發(fā)病機制及臨床防治提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻

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(學(xué)術(shù)編輯:蒲素)

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.010.html

Effect of protein kinase Cα on the expression of oncofetal FN in human mesangial cells by high glucose

DU Chao1，JIANG Zhi1，XIONG Qin-pan1，ZHOU Bo2

(1.Department of Endocrinology，The People’s Hosptial of Yuechi，Yuechi 638300，Sichuan; 2.Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，Chongqing，China)

【Abstract】Objective: To investigate the level of protein kinase Cα(PKCa)，oncofetal fibronectin (oncofetal FN)in human mesangial cells(HMCs)exposed to high glucose，and explore the relationships of PKCa with expression of oncofetal FN mRNA.Methods: HMCs were divided into the following groups: normal glucose group(NG，D-glucose 5 mmol/L)，osmotic control group(LG，D-glucose 5 mmol/L + L-glucose 20 mmol/L)，high glucose group(HG，D-glucose 25 mmol/L)，and high glucose + Safingol group(HS，D-glucose 25 mmol /L + Safingol 40 μmol /L).The expression and translocation of PKCa protein was observed by confocal laser scanning microscopy，The mRNA expression of oncofetal FN were detected by RT-PCR.Results: (1)High glucose induced PKCa translocation from cytosol to nucleus，and quantitative analysis showed the ratio of plasma/nuclear fluorescence intensity in HG group decreased 20％ compared with NG group (P＜0.05).Oncofetal FN mRNA in HG group was up-regulated，with 2.36 folds of NG group(P＜0.05).(2)Compared with HG group，the activation of PKCa in group HS was inhibited and the ratio of plasma/nuclear fluorescence intensity increased 15％.Besides，the mRNA expression of oncofetal FN in group HS was 45％ down-regulated compared with group HG (both P＜0.05).Conclusion: High glucose increase the expression of oncofetal FN in HMCs，which related to the activation of PKCa.

【Key words】Protein kinase Cα; Oncofetal fibronectin; High glucose; Mesangial cells

通訊作者:蔣智，E-mail:9395286@qq.com

作者簡介:杜超(1982-)，男，四川廣安人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病微血管并發(fā)癥防治研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金(81370940)

收稿日期:2014-06-28

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.10

【文章編號】1005-3697(2015)01-0043-04

【中圖分類號】R692.9

【文獻標(biāo)志碼】A