甘肅當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預作用*

鄧 毅，張 明，張艷萍

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫藥大學；3甘肅中醫藥大學附屬醫院

甘肅當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預作用*

鄧 毅1，2，張 明2，張艷萍3

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫藥大學；3甘肅中醫藥大學附屬醫院

目的：比較甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏不同產地當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠的干預作用。方法：建立乙酰苯肼溶血性血虛模型，給予當歸水煎液［1.56 g/(kg·d）］22天后，檢測外周血紅細胞（RBC）、血紅蛋白（H G B）、紅細胞壓積（H CT）、白細胞（W BC）、血小板（PLT）、紅細胞膜鈉-鉀-A TP酶（N a+-K+-A TP）和鈣-鎂-A TP酶（Ca2+-M g2+-A TP）活性，并觀察肝臟指數（LI）、脾臟指數（SI）、胸腺指數（TI）的變化。結果：與模型組比較，岷縣當歸能提高RBC、H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），臨夏當歸能提高H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），渭源當歸能提高H G B、H CT降低PLT（P＜0.05），禮縣當歸能降低PLT（P＜0.05）；岷縣當歸能提高N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05），禮縣當歸能提高N a+-K+-A TP酶活性（P＜0.05），臨夏當歸能提高Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05）；甘肅產各當歸均能降低LI（P＜0.05），有降低SI的趨勢，岷縣、禮縣、渭源當歸能升高TI（P＜0.05）。結論：甘肅當歸［1.56 g/(kg·d）］具有明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象相關指標,提高紅細胞膜A TP活性，降低肝脾指數，升高胸腺指數的作用，綜合比較岷縣當歸作用較強。

甘肅當歸；溶血性血虛；外周血象；紅細胞膜A TP酶；器官指數

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv) Diels.的根，主產于甘肅省東南部的岷縣(秦州)，其性甘溫質潤，長于補血，為“補血之圣藥”［1］。甘肅岷縣當歸歷代均被譽為道地藥材，《本草求真》云：“當歸專入心。辛甘溫潤，諸書載為入心生血上品。”故用當歸補心血，心得血養則諸證自除［2］。本實驗考察甘肅不同產區當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預作用，為當歸的補血作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 2013年3月購試驗所用當歸于甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏及云南，由甘肅中醫藥大學中藥鑒定學教研室楊扶德教授鑒定為正品。當歸水煎液的制備：稱取各產地當歸10 g，分別加水80 mL，浸泡30分鐘，煎煮60分鐘，過濾，收集藥液，藥渣中再加入60 mL水煎煮30分鐘，過濾，合并兩次濾液，水浴濃縮至100 mL，含生藥量0.1 g/mL，3～4℃冰箱保存備用［3］。驢膠補血顆粒(九芝堂股份有限公司生產，批號：2012080220)，水溶液制備：取驢膠補血顆粒30 g，加生理鹽水配制成90 mL溶解，含原藥量0.33 g/mL。

1.2 動物 SPF級昆明種小鼠128只，體質量18～22 g，雌雄各半，由蘭州大學實驗動物中心提供，動物實驗許可證號：SCXK(甘)2013-0002。

1.3 試劑 肝素鈉(中國醫藥集團上海化學試劑公司生產，批號：F20091231)；乙酰苯肼(天津市光復精細化工研究所生產，批號：20130313)；ATP酶測試盒(批號：20130423)，蛋白質快速染色試劑盒(批號：20130503)，考馬斯亮藍G250法，均購于南京建成科技有限公司。

1.4 儀器 Abacus Junior vet5動物血球儀(美國ABBOTT公司提供)；MODEL680酶標儀(美國伯樂公司提供)；Boifuge stratos高速冷凍離心機(美國科俊儀器公司提供)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司提供)；XH-B漩渦混勻器(姜堰市康健醫療器具有限公司提供)。

1.5 方法

1.5.1 溶血性血虛小鼠模型的復制 參照文獻方法［4-5］，除空白對照組外，其余7組小鼠分別于灌胃第1、4、7、12、17、22天進行皮下注射2%乙酰苯肼(APH)溶液，第一次劑量為200 mg/kg，其余每次劑量為100 mg/kg。

1.5.2 分組與給藥 將128只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(驢膠補血顆粒組)、岷縣當歸組、禮縣當歸組、渭源當歸組、臨夏當歸組、云南當歸組，每組16只。模型建立后，空白對照組和模型對照組按15.6 mL/kg生理鹽水灌胃；各當歸藥物組給藥劑量根據成人劑量12 g/70(kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量1.56 g/(kg·d)（含生藥量0.1 g/mL），故各當歸組均按15.6 mL/kg劑量(含生藥量0.1 g/mL)灌胃；陽性對照組給藥劑量根據成人劑量40 g/70 (kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量5.2 g/(kg·d)(含藥量0.33 g/mL)，灌胃劑量為15.6 mL/(kg·d)。以上各組灌胃1次/d，連續22天。

1.6 檢測指標

1.6.1 外周血象指標的檢測 所有各組于末次給藥24小時后，眼眶取血20 μL，加入已添加肝素鈉的離心管中，用移液槍輕微混勻，采用動物血球儀測定RBC、HGB、HCT、WBC、PLT。

1.6.2 紅細胞膜A TP酶活性的檢測 眼眶取血后，各組小鼠股動脈采血(肝素鈉抗凝)，加4倍生理鹽水，使用冷凍離心機3 000 r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，在沉淀的紅細胞中加入0.75mL雙蒸水，渦旋30秒，放置15分鐘，再渦旋30秒，再放置15分鐘，使其充分溶血，直至溶質透亮［6］。嚴格按ATP酶試劑盒(定磷法)操作說明測定紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.6.3 肝臟、脾臟及胸腺指數測定 小鼠取血后處死，取肝臟、脾臟、胸腺稱重，以mg/g單位計算肝臟指數、脾臟指數和胸腺指數。

肝臟指數(LI)=肝臟濕重×1 000/體質量(單位g)

脾臟指數(SI)=脾臟濕重×1 000/體質量；胸腺指數(TI)=胸腺濕重×1000/體質量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計分析軟件進行數據處理，計量資料數據以表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周RBC、H G B、H CT、W BC、PLT檢測結果 模型組的RBC、HGB、HCT和WBC、PLT與空白組比較有顯著下降和上升(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當歸能提高RBC、HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，臨夏當歸能提高HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，渭源當歸能提高HGB、HCT及降低PLT(P＜0.05)，禮縣當歸能降低PLT(P＜0.05)。見表1。

2.2 紅細胞膜N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性檢測結果 模型組的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與空白組比較有顯著下降(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當歸能提高 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)，禮縣當歸能提高Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05)，臨夏當歸能提高Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)。見表2。

2.3 肝臟、脾臟及胸腺指數測定 模型組的LI、 SI和TI與空白組比較有顯著上升和下降(P＜0.05)。與模型組比較，甘肅各當歸均能降低LI(P＜0.05)，有降低SI的趨勢，岷縣、禮縣、渭源當歸能升高TI(P＜0.05)。見表3。

表1 對小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

表1 對小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與空白組比較，◇◇表示P＜0.01（下同）。

組別 只數 劑量/（g·kg-1）RBC(×1012)/L H G B/(g·L-1) H CT/% W BC(×109)/L PLT×109/L空白對照 16 - 13.48±2.21 377.67±44.02 59.27±9.05 7.08±2.28 838.63±201.07模型對照 16 - 8.29±2.31◇◇276.87±9.05◇◇45.67±12.14◇◇13.57±4.84◇◇1295.43±180.05◇◇陽性對照 16 5.20 9.83±1.14*325.94±15.96**54.38±7.04**7.77±3.78**917.73±280.32**岷縣當歸 16 1.56 10.69±1.65**326.47±34.18**59.69±8.94**9.14±3.53**868.73±204.75**禮縣當歸 16 1.56 9.29±0.82 300.47±17.42 51.59±5.08 12.02±4.16 918.80±159.23**渭源當歸 16 1.56 9.23±1.52 314.00±20.62**55.02±5.47**11.36±3.08 1054.00±211.82**臨夏當歸 16 1.56 9.44±1.35 304.13±24.80*52.30±7.29*9.66±3.39**1079.00±213.81**云南當歸 16 1.56 9.18±1.67 324.64±28.68 51.08±8.60 9.58±3.08 1107.47±242.95

表2 對小鼠紅細胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

表2 對小鼠紅細胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

組別 只數 劑量/（g·kg-1） N a+-K+-A TP Ca2+-M g2+-A TP空白對照 16 - 26.86±9.74 43.20±14.53模型對照 16 - 11.64±6.17◇◇14.44±8.69◇◇陽性對照 16 5.20 24.24±10.22**36.84±14.70**岷縣當歸 16 1.56 23.98±8.55**32.74±7.28*禮縣當歸 16 1.56 21.75±5.81*27.17±16.63渭源當歸 16 1.56 18.04±7.86 21.54±15.31臨夏當歸 16 1.56 13.07±8.50 31.94±16.84*云南當歸 16 1.56 18.76±8.64 26.84±13.81

表3 對小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

表3 對小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

組別 只數 劑量/（g·kg-1） LI/(m g·g-1) SI/(m g·g-1) TI/(m g·g-1)空白對照 16 - 32.92±3.66 2.09±0.49 2.23±0.82模型對照 16 - 48.48±5.39◇◇11.95±2.26◇◇1.48±0.50◇◇陽性對照 16 5.20 41.55±1.98**10.13±2.34*2.18±0.80*岷縣當歸 16 1.56 40.92±2.53**10.74±1.76 2.17±1.16*禮縣當歸 16 1.56 44.76±3.25*11.82±2.32 2.05±0.83*渭源當歸 16 1.56 43.16±3.03**11.11±2.18 2.05±0.62*臨夏當歸 16 1.56 44.21±4.59**11.69±3.45 1.95±0.52云南當歸 16 1.56 46.87±6.96 11.26±2.64 2.09±0.64

3 討論

溶血性貧血(hemolytic anemia)是指紅細胞破壞加速，骨髓造血功能代償不足時發生的貧血，多見于紅細胞自身異常和紅細胞外部異常兩類。有分析認為血虛與情志、不良飲食、體質、疾病、失血、生育、藥毒損傷有關［7］。本實驗采用乙酰苯肼建立溶血性血虛模型，誘導小鼠外周RBC、HGB、 HCT降低，WBC、PLT升高，紅細胞膜Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP活性降低，肝脾腫大，胸腺萎縮。RBC為運送氧氣的主要媒介且具免疫功能；HGB含量的高低代表著血虛的程度；HCT反映紅細胞的濃度；WBC為免疫細胞，具有吞噬異物產生抗體的作用；PLT在止血過程發揮重要作用［8］。紅細胞膜結構和功能的完整是紅細胞發揮功能的重要保證，而紅細胞的功能主要是通過膜蛋白來實現的。細胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜內高鉀，膜外高鈉的平衡，能將ATP分解為ADP并產生能量，對維持紅細胞的形態和功能具有重要作用，在血虛狀態下其活力明顯降低［9］；Ca2+-Mg2+-ATP維持細胞外高鈣，細胞內高鎂的水平，亦可分解ADP以獲得能量［10］。中醫認為肝藏血，脾統血為“氣血生化之源”，肝脾的功能失常可以引起血虛。脾臟是人體最大的免疫器官，因此脾臟腫大、胸腺萎縮，將導致機體免疫功能低下，在一定程度會引起機體造血機能的低下，表現為中醫血虛的病癥［11］。本實驗結果表明，甘肅當歸能明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象，提高紅細胞膜ATP酶活性，降低肝脾指數，升高胸腺指數，對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠具有較好的治療作用，綜合比較岷縣當歸作用較強。

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Intervention of Gansu DangGui on the Mice Models with Acetyl Phenyl Hydrazine-induced Hemolytic Blood-deficiency

DENG Yi1,2,ZHANG Ming2,ZHANG Yanping3
1 Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province(nurturing station),Lanzhou 730000,China;2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine; 3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective:To compare the intervention of DangGui(Angelica sinensis)of Minxian,Lixian, Weiyuan,Linxia ofGansu province on mice models with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency. Methods:The model with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency was established and given DangGui water decoction[1.56 g/(kg·d)]for 22 days,to detect red blood cells(RBC),hemoglobin(HGB),hematocrit(HCT),white blood cells(WBC),platelet(PLT),the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme in red cell membrane,and observe the changes of liver index (LI),spleen index (SI)and thymus index(TI). Results:Compared with the model group,Minxian Danggui could raise RBC,HGB and HCT but decrease WBC and PLT(P＜0.05),Linxia Danggui could increase HGB and HCT but lower WBC and PLT(P＜0.05),Weiyuan Danggui could increase HGB and HCT,but decrease PLT (P＜0.05),Lixian Danggui could decrease PLT (P＜0.05); Minxian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05),Lixian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme(P＜0.05),Linxia Danggui could improve the activity of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05);Gansu Danggui could lower LI(P＜0.05),showing the tendency of decreasing SI, Minxian,Lixian and Weiyuan Danggui could increase TI(P＜0.05).Conclusion:Gansu Danggui[1.56 g/(kg·d)] could improve the related indexes in peripheral blood of mice with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency obviously,improve the activity of ATP in red blood cell membrane eividently,decrease liver and spleen indexes and increase TI,and Minxian Danggui shows the strongest function comprehensively.

Gansu DangGui;hemolytic blood-deficiency;peripheral blood;ATP enzyme of red blood cell membrane;organ index

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0005-04

2014-12-27

甘肅省高等學校基本科研業務費項目(編號2009-4)。

鄧毅(1964—)，男，博士研究生導師，教授。研究方向：中藥及復方藥效基礎的應用研究。