湖北省仙桃地區(qū)2012年鼠類攜帶漢坦病毒的基因特征研究

彭 延，鄒文菁，李國明(湖北省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所病原檢測中心，武漢 430079)

?

·論 著·

湖北省仙桃地區(qū)2012年鼠類攜帶漢坦病毒的基因特征研究

彭 延，鄒文菁，李國明(湖北省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所病原檢測中心，武漢 430079)

目的 研究湖北省仙桃地區(qū)2012年捕獲鼠類種類和攜帶漢坦病毒情況，分析漢坦病毒的基因特征。方法 在湖北省仙桃地區(qū)以夾夜法捕鼠。無菌解剖后取鼠肺提取總RNA，熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測漢坦病毒，陽性標(biāo)本進行病毒S片段序列測定和進化分析。結(jié)果 捕獲鼠類共100只，其中黑線姬鼠64只，占64%;褐家鼠6只，占6%;小家鼠13只，占13%;黃胸鼠17只，占17%。共檢出漢坦病毒核酸陽性鼠肺2只，分型為漢灘型。結(jié)論 仙桃地區(qū)漢坦病毒宿主以黑線姬鼠為主，所攜帶病毒以漢灘型為主，基因型有明顯地域特點,屬于文獻報道的新亞型。

漢坦病毒； 基因分型； 序列分析

漢坦病毒(HV)在臨床上主要引起歐亞大陸的腎綜合征出血熱和美洲地區(qū)的HV肺綜合征。我國為腎綜合征出血熱高危流行區(qū)，涉及26個省、市、自治區(qū)，約占全球發(fā)病總數(shù)的90%以上[1]。近年來，湖北省腎綜合征出血熱在仙桃等局部地區(qū)疫情上升較快，在地區(qū)分布上,湖北省腎綜合征出血熱發(fā)病呈明顯聚集性特征。本研究通過監(jiān)控流行地區(qū)鼠種及HV感染情況，運用分子生物學(xué)的方法進行了HV的檢測和序列分析，了解本地區(qū)HV毒株的型別和特征，為制訂有針對性的腎綜合征出血熱預(yù)防控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2012年1～12月在湖北省仙桃市采用夾夜法捕鼠。現(xiàn)場鑒定鼠種并無菌解剖取鼠肺組織，置-70 ℃冰箱保存。

1.2 RNA的提取 利用組織研磨器均質(zhì)鼠肺后，參照QIAGEN公司Rneasy Mini Kit提取試劑使用說明書進行。

1.3 HV的熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 使用上海之江公司的HV熒光PCR試劑盒，按說明書操作。

1.4 病毒S片段的擴增和測序 對HV的熒光PCR陽性樣本的RNA使用SuperscripTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶和P14引物(5-TAG TAG TAG ACT CC-3′),按說明書合成cDNA。S部分片段擴增方法參考文獻[2]。反應(yīng)產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)生分析和同源性分析 用BioEidt軟件對測序結(jié)果進行拼接。將結(jié)果登陸GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，用MEGA5.2軟件進行同源性分析。研究中用于比較的毒株來源GenBank，見表1。

表1 研究中相關(guān)比較毒株及來源

注：-表示未指明。

2 結(jié) 果

2.1 鼠類的構(gòu)成和帶毒情況 2012年仙桃地區(qū)捕獲鼠類共100只，其中黑線姬鼠64只，占64%；褐家鼠6只，占6%；小家鼠13只，占13%；黃胸鼠17只，占17%。在黑線姬鼠中檢出HV核酸陽性鼠肺2只，編號分別為XT015、XT016。

2.2 病毒S基因片段的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 Xiantao15、Xiantao16測序結(jié)果提交NCBI BLAST進行對比，結(jié)果提示其與湖北省地區(qū)漢灘型(hantann,HTNV)型病毒毒株序列一致性最高，為97%。與其他HTNV序列一致性為90%～91%。這表明檢測到的病毒分型為漢灘型。系統(tǒng)進化分析用MEGA5.2軟件對GenBank的其他毒株進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果見圖1。

圖1 基于S片段部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

腎綜合征出血熱是以鼠類為主要傳染途徑的自然疫源性疾病，鼠密度、宿主動物病毒感染率及與人群接觸機會的不同，均能影響該病傳播。其中HV和宿主間有最為緊密的對應(yīng)關(guān)系，一種宿主一般只攜帶一種HV，因此宿主動物的種群類別決定了其攜帶的HV型別和人間HV流行強度。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖北省仙桃地區(qū)的嚙齒動物HV攜帶率為2%，優(yōu)勢鼠種是黑線姬鼠，也是HV的主要傳染源。武漢地區(qū)腎綜合征出血熱發(fā)病數(shù)相對較高的江夏區(qū)、新洲區(qū)2009～2011年攜帶率是4．05%[3]。相比以上地區(qū),仙桃嚙齒動物HV攜帶率還處在較低水平。

HV至少有40多種血清型或基因型，每一種血清型或基因型由1種或幾種密切相關(guān)的嚙齒動物攜帶傳播，與宿主共進化,并且具有明顯的地區(qū)聚集現(xiàn)象，許多疫區(qū)都存在著各自的優(yōu)勢HV基因型或亞型[4-5]。過去的研究表明，通過病毒基因組核苷酸序列的分子進化分析，HTNV可分為9個亞型[5-6]。湖北省腎綜合征出血熱患者中曾檢測到HTNV第7和第9亞型[7-8]。最新相關(guān)文獻報道，湖北省存在1個HTNV新亞型[9]。本研究中，測序的Xiantao15/Xiantao16毒株S片段和報道的新亞型HV004株明顯處于同一分支，序列比對也顯示同源性達到97%。由此可見，Xiantao15/Xiantao16也屬于這一新亞型。研究結(jié)果提示，近來湖北HV流行毒株以新亞型為主，新亞型的出現(xiàn)是否是引起湖北省局部腎綜合征出血熱疫情上升到原因，值得進一步研究。

[1]閉福銀，譚毅，韋增良，等.廣西漢坦病毒全S基因核苷酸序列測定[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2010，16(6):325-328.

[2]李恒新,馬超鋒,左署青,等.西安地區(qū)2009年鼠類攜帶漢坦病毒的基因特征研究[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,32(4):433-435.

[3]劉東瀛,劉婧，李金林,等.湖北省武漢地區(qū)嚙齒動物漢坦病毒S基因的特征分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2012,33(8):828-831.

[4]耿英芝，田疆，劉蕓，等.遼寧省漢城型漢坦病毒基因亞型分析[J].中國公共衛(wèi)生,2012,28(12):1594-1596.

[5]王世文,杭長壽,王華,等.我國漢坦病毒基因型和基因亞型的分布研究[J].病毒學(xué)報,2002，18(3)：211-215.

[6]程茂玲,喬剛.青島地區(qū)腎綜合征出血熱病毒基因分型[J].檢驗醫(yī)學(xué),2011,26(8):523-525.

[7]Wang H,Yoshimatsu K,Ebihara H,et al．Genetic diversity of hantaviruses isolated in China and characterization of novel hantaviruses isolated from Niviventer confucianm and Apodemus agrarius[J]．Virology，2000，278(2)：332-345．

[8]丁曉華,楊占秋,肖紅,等.漢灘病毒M片段的核苷酸序列變異和系統(tǒng)發(fā)生樹分析[J]．病毒學(xué)報,2003,19(2)：169-172．

[9]Li JL,Ling JX,Liu DY,et al.Genetic characterization of a new subtype of Hantaan virus isolated from a hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) epidemic area in Hubei Province,China[J].Arch Virol,2012,157(10):1981-1987.

Study on genetic characteristics of Hantavirus carried by murids in Xiantao city of Hubei province during 2012

PENGYan,ZOUWen-jing,LIGuo-ming

(HubeiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan430079,China)

Objective To study the species of captured murids in Xiantao area during 2012 and their carrying Hantavirus situation,and to analyze the gene characteristics of Hantavirus.Methods The night trapping method was used to capture murines.After sterility dissection,the murine lung was taken for extracting total RNA.Hantavirus was detected by fluorescent PCR.The positive samples were performed the viral S segments sequence determination and evolution analysis．Results Altogether 100 murines were captured including 64 cases (64%) of Apodmus agrarius,6 cases(6%) of Rattus norvegicus,13 cases (13%) of Mus musculus and 17 cases(17%) of Rattus flavipectu.2 murine lungs with Hantavirus nucleic acid positive and the virus genotyping was Hantaan virus.Conclusion The hosts of Hantavirus in Xiantao in 2012 were mainly Mus musculus,the carrying virus is mainly Hantaanvirus,and the genotype has obvious regional characteristic,which belongs to new subtype reported by literature.

hantavirus； genotyping； sequence analysis

彭延，男，碩士，主管技師，主要從事病原檢測方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.028

A

1672-9455(2015)18-2720-02

2015-04-28

2015-05-04)