乳腺癌中STC1的表達與乳腺癌肺轉移相關

李佳濤 李 惠 胡國宏

（上海交通大學醫學院/中國科學院上海生命科學研究院健康科學研究所 上海 200025）

乳腺癌中STC1的表達與乳腺癌肺轉移相關

李佳濤 李 惠 胡國宏△

（上海交通大學醫學院/中國科學院上海生命科學研究院健康科學研究所 上海 200025）

目的研究乳腺癌中分泌蛋白斯坦尼鈣調節蛋白1（stanniocalcin 1，STC1）的表達與乳腺癌轉移的關系。方法用質譜及Western blot分析STC1在具有不同轉移能力細胞系中的蛋白表達情況。熒光定量RTPCR（qRT-PCR）分析STC1 mRNA在乳腺癌細胞系及23例患者樣本中的表達情況，并通過網上數據庫分析1 609例乳腺癌患者STC1 mRNA的表達水平與患者發生遠端轉移之間的關系。結果質譜及Western blot分析結果顯示，具有高轉移能力的乳腺癌細胞系高表達STC1。qRT-PCR分析結果顯示，STC1在高轉移乳腺癌細胞系中高表達，STC1在轉移性乳腺癌患者中的表達高于非轉移性患者。另外，通過對數據庫中乳腺癌患者樣本的分析發現，原位癌高表達STC1的乳腺癌患者更容易發生遠端轉移。結論STC1的表達與乳腺癌的轉移具有相關性，提示STC1具有臨床預測乳腺癌肺轉移的潛在價值。

STC1； 乳腺癌； 腫瘤轉移； 生物標志物

乳腺癌發病率高，對女性健康構成很大威脅，而乳腺癌轉移是引起不良預后的重要原因［1］。腫瘤的轉移具有器官特異性，其中乳腺癌最常見的轉移部位是骨、肺、肝及腦［2］。乳腺癌骨轉移會給患者帶來疼痛、骨折和高鈣血等，而乳腺癌的肺轉移會給患者帶來致命的傷害［3］。早期發現、早期預測乳腺癌的轉移對于乳腺癌的治療具有重要意義。

斯坦尼鈣調節蛋白1（stanniocalcin 1，STC1）是一種分泌型糖蛋白，由STC1基因編碼，位于人染色體8p11.2～p21。STC1最初發現于魚類中，進一步研究發現人類及其他哺乳動物中也廣泛存在STC1［4］。通過對哺乳動物中該蛋白的同源蛋白進行分析，還發現了另一斯鈣素家族成員STC2［5］。STC1表達于多種組織，通過自分泌或旁分泌發揮功能［6］。目前已知STC1在調節腎及小腸鈣磷平衡及細胞代謝等方面發揮著重要功能［7］，而對STC2的功能尚不清楚。

STC1及STC2在多種腫瘤組織的表達量都比對應的癌旁正常組織有明顯升高或降低，提示STC可能與腫瘤的發生發展有關。研究發現在卵巢癌中STC1的表達較癌旁有所下調［8］；在肝癌組織中STC1的表達較癌旁有所上調［9］；STC2在肝癌中的表達也有上調且能促進肝癌細胞體外增殖能力［10］。乳腺癌中，STC1可能會被BRCA1基因誘導而產生［11］；在ER陽性乳腺癌中，STC1及STC2在腫瘤組織中的表達較癌旁正常組織明顯上升［12］，其中STC2的高表達可能受激素調節［13］。另有研究提示STC1可做為乳腺癌的一種臨床診斷標志物［14］。STC還參與腫瘤轉移的過程，有研究顯示腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）分泌的STC1可以促進節腸癌細胞發生轉移［15］；STC2與食管癌的淋巴節轉移相關等［16］。具有低肺轉移能力的乳腺癌細胞系中過表達STC1后，可以增強該乳腺癌細胞系的肺轉移能力［17］。但是，STC1的表達是否與乳腺癌轉移能力相關，以及在臨床上STC1的表達與患者預后發生遠端轉移風險是否相關，尚不明確。因此，本研究旨在探討STC1在乳腺癌中的表達與乳腺癌肺轉移的關系，揭示STC1與乳腺癌轉移的相關性，為預測及診斷乳腺癌的轉移提供理論依據。

材料和方法

細胞培養LM2-4173及LM2-4175（分別簡稱4173及4175）來源于Joan Massague實驗室［18］。MDA231、4173、4175以及4T1系列細胞的培養使用DMEM加10%胎牛血清、100 U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素的培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。MCF10系列細胞的培養（MCF10AT，MCF10CA1h，MCF10CA1a）使用DMEM/F12（HyClone）加10μg/m L胰島素、20 ng/m L表皮生長因子、0.5μg/m L氫化可的松、100 ng/m L霍亂毒素，5%馬血清，100 U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素的培養液、置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

樣本來源23例乳腺癌患者腫瘤樣本均來自山東大學齊魯醫院，其中12例患者預后發生了肺轉移，11例患者預后未發生轉移，腫瘤樣本分成轉移組與非轉移兩組。網上乳腺癌患者樣本數據來源于www.kmplot.com，選擇研究對象為乳腺癌（breast cancer），考查指標為遠端轉移（distant metastasis free survival，DMFS）。將1 609例乳腺癌患者樣本按表達的STC1中值分為兩組：STC1高表達組和STC1低表達組，然后比較兩組發生DMFS的生存曲線。

STC1 mRNA表達檢測采用Trizol法提取細胞或組織總RNA，然后取RNA 1μg，利用隨機引物及polyd T進行逆轉錄。隨后用熒光定量RT-PCR （qRT-PCR）法檢測具有不同轉移能力的細胞系及乳腺癌患者樣本中STC1 mRNA的表達水平，引物序列見表1。

STC1蛋白表達檢測分泌蛋白收集方法及質譜分析方法參考文獻［19］。分泌蛋白的Western blot檢測使用10%SDS電泳分離，轉膜后用麗春紅（Ponceau S）確定上樣蛋白量是否相同。兔源抗STC1一抗為多克隆抗體購于美國Gene Tex公司（批號：GTX47080）。熒光標記的抗兔二抗來源于Li-Cor公司。

統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。qRT-PCR法檢測STC1 mRNA表達，數據以±s表示。分析乳腺癌患者腫瘤樣本時，采用Student's t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

質譜數據分析具有不同肺轉移能力的乳腺癌細胞系的分泌蛋白為了找到在乳腺癌肺轉移中起著重要作用的分泌蛋白，通過液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）分析來自具有不同遺傳背景且具有不同肺轉移能力的乳腺癌細胞系——MDA-MB-231系列（231及4175）和來自鼠源的4T1系列（67NR、168FARN、4TO7及4T1）的分泌蛋白情況。4T1系列細胞系（包括67NR、168FARN、4TO7、4T1）均來自小鼠自發乳腺癌模型，其中67NR及168FARN均無肺轉移能力，4TO7及4T1細胞可以擴散到肺，但只有4T1能長成肉眼可見的轉移灶［20-21］。MDA-MB-231（簡稱231）是肺轉移能力較弱的人源乳腺癌細胞系，LM2-4173及LM2-4175（分別簡稱4173及4175）是來自于231細胞系的具有高肺轉移能力的乳腺癌細胞系［18］。在這2個細胞系的分泌蛋白中，有7個蛋白被共同上調或者下調，包括蛋白酶分子和生長因子等。STC1是其中被共同上調的分泌蛋白之一，STC1在高肺轉細胞系中具有高表達情況（圖1A）。為了進一步確定，本研究采用Western blot驗證了STC1在MDA-MB-231系列細胞系的條件培養液上清中的表達情況。由于抗STC1一抗無法與鼠源STC1相互作用，故4T1系列細胞系的STC1蛋白表達用Western blot未能檢測到。進一步驗證MCF10A系列細胞系（10AT、CA1h及CA1a）中STC1分泌蛋白的表達情況（圖1B）。MCF10系列也是人源細胞系，其中MCF10AT（簡稱10AT）是人源乳腺癌細胞系，能在裸鼠上形成良性腫瘤；MCF10CA1h（簡稱CA1h）是能形成分化程度較高的腫瘤，且具有肺轉移能力；MCF10CA1a（簡稱CA1a）能形成分化程度較低的腫瘤，且能通過尾靜脈注射形成肺轉移灶，其轉移能力較強［22-23］。

高肺轉能力細胞系4 173及4 175的STC1表達明顯高于低肺轉能力的231母系；高肺轉能力細胞系CA1h及CA1a的STC1表達明顯高于無肺轉能力的AT。

圖1 高肺轉細胞系分泌高水平STC1蛋白Fig 1 Cell lines with high lung metastatic potential secreted more STC1 than those without metastatic ability

STC1在乳腺癌細胞系中的表達質譜數據以及Western blot數據顯示，分泌蛋白STC1在高轉移乳腺癌細胞系中的表達水平高于低肺轉能力的細胞系。為了確定在mRNA水平上STC1是否也在高肺轉系中高表達，本研究采用q RT-PCR法測定了STC1在MCF10系列、MDA-MB-231系列及鼠源4T1系列細胞系中的表達情況（圖2）：STC1m RNA的表達水平與蛋白表達水平結果一致，在具有高肺轉能力的細胞系CA1h、CA1a、4173、4175及4T1中的表達高于其他低肺轉或無肺轉能力的細胞系。

在患者樣本中STC1與乳腺癌轉移的關系在轉移組乳腺癌患者中，STC1的表達達明顯高于非轉移組患者，差異有統計學意義（P=0.049，圖3A）。另外，通過網上數據庫（www.kmplot.com）分析了1 609例乳腺癌患者原位癌STC1的表達與乳腺癌患者預后發生轉移的關系。原位癌高表達STC1的乳腺癌患者組發生轉移的風險更大，差異有統計學意義（P=0.013，圖3B）。

圖2 qRT-PCR檢測STC1 mRNA表達水平與乳腺癌細胞系的肺轉移能力Fig 2 Expression level of STC1 mRNA correlated with lung tropism in breast cancer all lines detected by qRT-PCR

圖3 乳腺癌患者腫瘤樣本STC1的表達量與發生轉移的風險正相關Fig 3 In breast cancer patients，the STC1 expression level in primary tumor samples correlates with metastasis risk

討 論

研究表明，在癌細胞改造腫瘤微環境的過程中，癌細胞的分泌蛋白（包括細胞因子、生長因子、蛋白酶等）作用非常關鍵［24-25］。金屬蛋白酶MMP1、MMP2是公認的對轉移具有促進作用的癌細胞分泌蛋白［26］。癌細胞分泌的分泌蛋白不僅能改變腫瘤的微環境，而且能在癌細胞到達轉移靶器官之前通過循環系統到達轉移靶器官并改造靶器官，從而使其成為適于癌細胞生長的土壤［27］。分泌蛋白存在于癌細胞外，容易在血液或體液中被檢測到，也容易通過藥物進行靶向治療。因此，腫瘤的分泌蛋白組學研究可以為腫瘤的早期診斷及靶向治療提供重要依據，具有重要的臨床應用價值。

通過液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）對比分析具有不同遺傳背景及不同轉移能力的乳腺癌細胞系的分泌蛋白組，我們發現了在高肺轉移細胞系中高表達的分泌蛋白STC1。通過q RT-PCR及Western blot方法進一步驗證了STC1在具有高肺轉能力的細胞系中高表達。另外，通過網上數據庫及患者樣本檢測，均發現STC1的表達與乳腺癌的轉移能力相關。以上結果中提示乳腺癌STC1的表達與乳腺癌轉移，特別是乳腺癌肺轉移密切相關。因此，臨床上有可能用STC1作為乳腺癌肺轉移的一種分子標志進行預測。

腫瘤的分泌蛋白可被腫瘤細胞分泌到細胞外并存在于組織液中甚至血液中，這使分泌蛋白更容易被檢測到并進行靶向治療。本研究發現乳腺癌患者原位癌STC1的表達與乳腺癌預后發生肺轉移風險具有一定的相關性。曾有報道提示分泌蛋白STC1也可以在血液中被檢測到［13］。因此，在今后的研究中應進一步關注乳腺癌患者血液中分泌蛋白STC1的表達水平與患者預后發生轉移的相關性，這可為臨床上通過檢測STC1的表達診斷及預防乳腺癌患者發生DMFS提供重要的理論依據。

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STC1 expression in breast cancer is correlated with breast cancer lung metastasis

LI Jia-tao，LI Hui，HU Guo-hong△
（Institute of Health Sciences，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University/Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200025，China）

ObjectiveTo investigate the expression of stanniocalcin 1（STC1）in breast cancer cell lines and its relationship with breast cancer metastasis.MethodsSTC1 protein expression in breast cancer cell lines was determined by Western blot and mass spectrum.STC1 mRNA expression in cell lines and 23 patient samples was determined by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）.Kaplan-Meier curves for distant metastasis free survival in breast cancer patients were determined based on the analysis of STC1 expression of 1 609 breast cancer patients from online database.ResultsIn breast cancer cell lines，STC1 secretion in cell lines with lung metastatic potential was higher than those without lung tropism as determined by Western blot and mass spectrum.In breast cancer patients，STC1 mRNA expression in patients with higher risk of lung metastasis was more than patients without metastasis risk.Kaplan-Meier curves for distant metastasis free survival analysis of online database showed that breast cancer patients with high STC1 expression were more likely to have distant metastasis.ConclusionsSTC1 expression is correlated with breast cancer metastasis，and may be a potential biomarker for breast cancer lung metastasis.

STC1； breast cancer； metastasis； biomarker

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.05.010

2015-03-06；編輯：段佳）

△Corresponding author E-mail：ghhu@sibs.ac.cn