急性百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液及血清炎性因子變化及姜黃素的干預(yù)效果

陳壽權(quán)，冷巧云，何愛文，劉玉榮，李惠萍，李章平，黃唯佳，程俊彥

急性百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液及血清炎性因子變化及姜黃素的干預(yù)效果

陳壽權(quán)，冷巧云，何愛文，劉玉榮，李惠萍，李章平，黃唯佳，程俊彥

目的：觀察百草枯（PQ）中毒大鼠急性肺損傷模型支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的變化及姜黃素的干預(yù)作用。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、中毒組、干預(yù)組。中毒組腹腔注射PQ 15mg/kg，干預(yù)組腹腔注射姜黃素200mg/kg，15min后腹腔注射PQ 15mg/kg，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1ml。各組分別按腹腔染毒或注射后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)分5個(gè)亞組。ELISA法測(cè)定各亞組大鼠BALF和血清IL-1β、TNF-α含量，光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，組間比較用Bonfer roni法，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，中毒組和干預(yù)組BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后6 h、24 h、3 d、7 d均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而中毒組BALF的IL-1β水平在染毒后3 h已開始升高（P＜0.01）；與中毒組比較，干預(yù)組BALF和血清IL-1β和TNF-α水平在染毒后24 h、3 d、7 d均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；中毒組、干預(yù)組BALF與血清IL-1β、TNF-α水平具有相關(guān)性。中毒組病理改變嚴(yán)重，干預(yù)組病理改變較中毒組減輕。結(jié)論：PQ中毒大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，BALF和血循環(huán)中TNF-α、IL-1β等炎性因子釋放增加，啟動(dòng)肺及全身炎癥反應(yīng)，可能是大鼠PQ中毒急性肺損傷的基本機(jī)制之一，姜黃素可通過(guò)此信號(hào)通路在一定程度上減輕肺損傷和全身炎性反應(yīng)。

百草枯；中毒；肺損傷；炎性因子；姜黃素

[Key words]paraquat；poison；lung injury；inflammatory factor；curcumin

百草枯（PQ）是劇毒類除草劑，對(duì)人畜毒性極強(qiáng)。在我國(guó)及亞太地區(qū)，PQ中毒在農(nóng)藥中毒中很常見。中毒患者病死率高達(dá)50%～80%[1-2]。肺臟為PQ中毒的主要靶器官，肺組織白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥介質(zhì)大量釋放，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)相互促進(jìn)，導(dǎo)致中毒早期的急性肺損傷[3-4]。炎癥因子與后期的肺纖維化也密切相關(guān)[5]。姜黃素是從中藥姜黃屬植物的根莖中提取的一種酚性色素，近年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有廣泛藥理作用，包括抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕炎癥反應(yīng)、肺損傷等作用[6-8]。本研究通過(guò)建立大鼠急性PQ中毒模型，觀察支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清IL-1β、TNF-α水平的變化以及姜黃素的干預(yù)影響，旨在為揭示在PQ致急性肺損傷及全身炎性反應(yīng)過(guò)程中姜黃素的干預(yù)效果提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠120只[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]，體重280～300 g；20%百草枯溶液（江蘇南通先正達(dá)公司）；姜黃素、玉米油（美國(guó)Sigma公司）；IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）。Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及PQ中毒模型 SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、中毒組、干預(yù)組，對(duì)照組按腹腔注射后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d各亞組（n=8），中毒組、干預(yù)組各按染毒后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d各亞組（n=8）。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1ml，并于24 h后處死取材；中毒組給予生理鹽水稀釋PQ（15mg/kg）至1ml一次性腹腔注射，干預(yù)組給予玉米油溶解后的姜黃素混懸液（200mg/kg）一次性腹腔注射，15min后給予生理鹽水稀釋PQ（15 mg/kg）至1ml一次性腹腔注射。各亞組分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)被處置取材。

1.2.2 血液的留取及BALF的制備 5%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉大鼠，開胸，經(jīng)左心室穿刺采血3ml，置于離心管中自凝3 h待檢；采血后處死大鼠，分離氣管及主支氣管，在近氣管分叉處結(jié)扎右主支氣管，將磨平的10ml注射器針頭插入氣管內(nèi)，直至左主支氣管末端后固定，緩慢注入3ml無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，待30 s后緩慢回抽，重復(fù)兩次（總共9ml生理鹽水），回收率均在80%以上，BALF置于離心管中，于4℃儲(chǔ)存，1 h內(nèi)離心，記錄BALF的回收量。

1.2.3 血清及BALF中IL-1β、TNF-α濃度測(cè)定將留取的血液1500 r/min離心5min，提取血清；取BALF經(jīng)1500 r/min離心10min后取上清液，血清與BALF上清液儲(chǔ)存于-20℃低溫箱中待測(cè)，采用ELISA法測(cè)定血清及BALF中IL-1β、TNF-α的水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢查 染毒后6 h，24 h，3 d，7 d取大鼠右肺組織，用4%多聚甲醛固定24 h，垂直氣道取材，酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片4μm厚。行常規(guī)HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來(lái)表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Bonfer roni法，以P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 各組BALF和血清IL-1β、TNF-α水平變化

與對(duì)照組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（亞組）比較，中毒組和干預(yù)組BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后6h、24h、3 d、7 d均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而中毒組BALF的IL-1β水平在染毒后3 h已開始升高（P＜0.01）；與中毒組比較，干預(yù)組BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后24 h、3 d、7 d均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

2.2 BALF與血清IL-1β、TNF-α水平相關(guān)性分析

中毒組BALF與血清的IL-1β水平呈正相關(guān)（r= 0.7198，P＜0.05），TNF-α水平亦呈正相關(guān)（r= 0.8476，P＜0.05）；干預(yù)組BALF與血清的IL-1β水平呈正相關(guān)（r=0.5572，P＜0.05），TNF-α水平亦呈正相關(guān)（r=0.6894，P＜0.01）。

2.3 光鏡下肺組織病理學(xué)改變 （1）對(duì)照組光鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄，肺泡間隔無(wú)增寬及充血，肺泡內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血現(xiàn)象。見圖1-A。（2）中毒組6 h可見肺泡結(jié)構(gòu)模糊，部分肺泡腔內(nèi)有水腫液，肺間隔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；24 h見肺泡腔內(nèi)充滿粉色水腫液，肺泡腔及間隔大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；3 d見肺泡腔內(nèi)水腫液及炎性細(xì)胞稍減少，出現(xiàn)肺泡間隔增寬現(xiàn)象；7 d見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少、水腫不明顯，但肺泡間隔明顯增寬，出現(xiàn)肺泡塌陷。見圖1-B、1-C、1-D、1-E。（3）干預(yù)組6 h、24 h、3 d、7 d各時(shí)間點(diǎn)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)滲出液及肺間隔增寬均較染毒組程度減輕。見圖1-F、1-G、1-H、1-I。

表1 各組大鼠血清和BALF中IL-1β、TNF-α水平的比較（pg/ml，）

表1 各組大鼠血清和BALF中IL-1β、TNF-α水平的比較（pg/ml，）

注：與對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與中毒組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；BALF，支氣管肺泡灌洗液；腫瘤壞死因子-α，TNF-α；白介素-1β，IL-1β

組別 時(shí)間點(diǎn)(亞組)血清TNF-α BALF TNF-α IL-1β IL-1β對(duì)照組3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 128.12±3.12 131.05±2.99 126.67±3.47 133.21±3.01 128.83±3.34 4.34±1.04 3.89±0.89 4.11±1.11 3.69±1.03 4.24±0.98 623.18±10.52 663.93±13.25 622.91±11.74 645.23±12.49 638.38±11.37 13.53±2.14 15.25±1.89 14.82±2.01 16.03±2.56 13.89±2.29中毒組3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 161.95±3.69 186.89±4.31**223.12±9.39**235.95±6.06**378.12±2.67**9.83±1.52**21.22±0.56**21.78±1.18**16.86±0.24**12.01±0.69**1020.73±18.27 1543.29±27.28**1862.67±26.51**2111.20±25.19**2567.62±30.19**19.28±3.91 30.19±3.67**35.87±4.01**27.84±3.19**24.91±2.89**干預(yù)組3 h 6 h 24 h 3 d 7 d n 88888 88888 88888 139.01±8.00 152.29±4.53*168.32±7.68**##218.73±7.73**#249.85±8.85**##6.73±1.51 19.10±0.68**11.73±1.55**##6.54±0.47*##6.34±0.88*##659.56±16.92 1489.23±28.17**1627.93±30.25**##1982.29±29.77**##2102.91±32.01**##18.22±2.89 28.28±3.69**27.88±3.37**##21.17±2.76**#19.89±3.13*#

3 討論

圖1 各組大鼠肺組織光鏡下病理學(xué)改變（HE×100）

TNF-α是由巨噬細(xì)胞釋放的前炎癥因子，能增加炎癥趨化因子和其他因子的釋放，并增加血管的通透性，最終導(dǎo)致白細(xì)胞的激活及大量炎癥因子的產(chǎn)生，是炎癥介質(zhì)“瀑布”樣反應(yīng)的始動(dòng)因子，可動(dòng)員、趨化、黏附、聚集、激活中性粒細(xì)胞（PMN），其作用貫穿機(jī)體炎性反應(yīng)的全過(guò)程[9]。IL-1β對(duì)巨噬細(xì)胞及PMN有趨化及黏附作用，通過(guò)釋放炎癥介質(zhì)、上調(diào)黏附分子、上調(diào)組織因子、下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）、激活血管內(nèi)皮細(xì)胞等生物學(xué)效應(yīng)，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用，增強(qiáng)TNF-α的損傷作用[10-12]。炎癥因子可直接引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷、毛細(xì)血管通透性增加、肺水腫及肺血管內(nèi)微血栓形成，TNF-α可誘導(dǎo)急性肺損傷（ALI）發(fā)生，降低血漿中TNF-α含量可使大鼠肺組織損傷程度減輕[13-15]。

研究顯示，PQ中毒可致大鼠肺組織中的TNF-α和IL-1β的表達(dá)量顯著升高[16]，其機(jī)制與PQ中毒后產(chǎn)生大量活性氧自由基刺激炎癥細(xì)胞因子釋放參與炎癥反應(yīng)相關(guān)[17]。本研究中中毒組染毒后6 h、24 h、3 d、7 d各時(shí)間點(diǎn)BALF和血清的TNF-α、IL-1 β均較對(duì)照組顯著升高，其中BALF的IL-1β水平更是在染毒后3 h已開始升高。肺組織病理改變嚴(yán)重，表明肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管肺泡和血循環(huán)中TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放增加，啟動(dòng)肺與全身炎癥反應(yīng)，是PQ中毒ALT的基本機(jī)制之一。

姜黃素是從中藥姜黃屬植物的根莖中提取的一種酚性色素，通常作為調(diào)味品及化妝品使用，研究發(fā)現(xiàn)Cu2+具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、降脂、抗誘變、抗腫瘤等作用[18]。用姜黃素干預(yù)膿毒癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其肺組織超氧化物歧化酶表達(dá)水平增加，BALF中的TNF-α、IL-8及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子顯著減少，大鼠肺水腫程度減輕，72 h存活率提高[19]。姜黃素可抑制脂多糖所誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而減輕氣道炎癥反應(yīng)[20]。姜黃素能減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，對(duì)ALI起保護(hù)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組肺組織血清和BALF中TNF-α、IL-1β濃度在染毒后24 h、3 d、7 d均顯著低于中毒組，肺組織病理變化程度也顯著輕于中毒組，初步提示姜黃素干預(yù)處理能通過(guò)減少PQ中毒大鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制TNF-α、IL-1β的釋放，減輕肺組織炎癥反應(yīng)和ALI程度，同時(shí)減輕全身炎性反應(yīng)。

在中毒組或干預(yù)組，BALF與血清的TNF-α、IL-1β水平之間均呈正相關(guān)，表明PQ中毒后肺組織和全身的炎性反應(yīng)損傷程度具有密切的相關(guān)性，而姜黃素干預(yù)對(duì)肺組織和全身炎性反應(yīng)損傷的抑制作用也具有協(xié)同性，值得從延長(zhǎng)時(shí)間窗和從不同劑量進(jìn)一步觀察研究。

[1] Ber tolote JM，F(xiàn)leischmann A，Eddleston M，et al. Deaths f rom pesticide poisoning：a global response[J].Br J Psychiat ry，2006，189（3）：201-203.

[2] 邱澤武，張瑞萍.化學(xué)除草劑百草枯中毒[J].人民軍醫(yī)，2004，47（11）：662-664.

[3] Jo YH，Kim K，Rhee JE，et al.Therapeutic hypothermia at tenuates acute lung injury in paraquat intoxication in rats[J].Resuscitation，2011，82（4）：487-491.

[4] Sun Y，Zhang J，Yan Y，et al.The protective ef fect of C-phycocyanin on paraquat-induced acute lung injury in rats[J].Environ Toxicol Pharmacol，2011，32（2）：168-174.

[5] Saddy F，Ol iveira GP，Garcia CS，et al.Assisted ventilation modes reduce the expression of lung inf lammatory and f ibrogenic mediators in a model of mild acute lung injury[J].Intensive Care Med，2010，36（8）：1417-1426.

[6] Chen KH，Chao D，Liu CF，et al.Curcumin at tenuates airway hyper reactivity induced by ischemia-reper fusion of the pancreas in rats[J]. Transplant Proc，2010，42（3）：744-747.

[7] Lee JC，Kinniry PA，Arguiri E，et al.Dietary curcumin increases antioxidant defenses in lung, amel iorates radiation-induced pulmonary f ibrosis，and improves survival in mice[J].Radiat Res，2010，173（5）：590-601.

[8] Guzel A，Kanter M，Aksu B，et al.Preventive effects of curcumin on dif ferent aspiration material-induced lung injury in rats[J].Pediat r Surg Int，2009，25（1）：83-92.

[9] 吳智勇，王志維，胡 銳，等.核因子-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在大鼠深低溫缺血再灌注所致急性肺損傷中的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（11）：2390.

[10]Barbieri SS，Ruggiero L，Tremoli E，et al.Suppressing PTEN activity by tobacco smoke plus inter leukin-1beta modulates dissociation of VE-cadherin/beta-catenin complexes in endothel ium[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（4）：732-738.

[11]Kasama T，Miwa Y，Isozaki T，et al.Neut rophi l-derived cytokines：potential therapeutic targets in inf lammation[J].Curr Drug Targets Inf lamm Al lergy，2005，4（3）：273-279.

[12]Amaral FA，F(xiàn)agundes CT，Gusbiraba R，et al.The role of macrophage migration inhibitory factor in the cascade of events leading to reper fusion-induced inf lammatory injury and lethality[J].Am J Pathol，2007，171（6）：1887-1893.

[13]Jackson WL Jr.Acute renal failure and sepsis [J].N Engl J Med，2004，351（22）：2347-2349.

[14]張 青，徐劍鋮，毛寶齡，等.內(nèi)毒素致傷大鼠肺組織TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)及NF-IL6活化研究[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2001，13（9）：523-526.

[15]姚麗君，師晶麗，呂明莊，等.短期針刺對(duì)急性肺損傷大鼠血漿白細(xì)胞介素-1β含量及海馬c-fos基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2011，18（3）：159-162.

[16]Tomita M，Okuyama T，Hidaka K，et al.Ear ly di fferential gene expression of rat lung af ter exposure to paraquat[J].Free Radic Res，2004，38（8）：821-829.

[17]Dinis-Oliveira RJ，Duar te JA，Sánchez-Navar ro A，et al.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，cl inical features，and treatment[J]. Crit Rev Toxicol，2008，38（1）：13-71.

[18] Araújo CC，Leon LL.Biological activities of Curcuma longa L[J].Mem Inst Oswaldo Cruz，2001，96（5）：723-728.

[19]Xiao X，Yang M，Sun D，et al.Curcumin protects against sepsis-induced acute lung injury in rats[J].J Surg Res，2012，176（1）：e31-e39.

[20]Chen D，Nie M，F(xiàn)an MW，et al.Anti-Inf lammatory Activity of Curcumin in Macrophages Stimulated by Lipopolysaccharides f rom Porphyromonas gingivalis[J].Pharmacology，2008，82（4）：264-269.

[21]Olszanecki R，Gebska A，Korbut R.The role of haem oxygenase-1 in the decrease of endothel ial intercel lular adhesion molecule-1 expression by curcumin[J].Basic Cl in Pharmacol Toxicol，2007，101（6）：411-415.

（收稿：2015-06-09 修回：2015-10-05 編校：齊 彤）

I nfluence of curcum in on changes of inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid and serum in acute paraquatpoisoned rats

C HEN Shou-quan，LENG Qiao-yun，He Ai-wen，LIU Yu-rong，LI Hui-ping，LI Zhang-ping，HUANG Wei-jia，CHENG Jun-yan.Department o f Emergency，The First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical Uni?versity，ZhejiangWenzhou 325000,China

Objective：To study the changes of interleukin-1β(IL-1β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and serum in ratsw ith acute paraquat(PQ)poisoning,and the intervention effectof curcumin.Methods：A total of 120 adultmale Sprague-Dauley(SD)ratswere random ly divided into control,PQ-poisoned and curcum in-intervened groups.Rats in PQ-poisoned group,curcum in-intervened group,controlgroupwere intraperitoneally adm inisteredw ith PQ 15mg/kg,PQ 15mg/kg at 15min after curcumin 200mg/kg,normal saline(NS)1m l,respectively.Each group divided further into 5 subgroups by time pointsat3 h,6 h,24 h,3 d,7 d after intraperitoneal contam ination or injection.The levelsof IL-1β,TNF-αin serum and BALFwere measured w ith enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA).Pathological changes in lung were observed by lightm icroscope.Experimental datawere treated w ith single-factor analysisof variance and compared between groupsby Bonferronimethod,and correlation analysiswas performed by Pearson correlation coefficient.Results：Compared w ith the controlgroup,TNF-αand IL-1βlevels in BALF and serum increased significantly at6 h,24 h,3 d,7 d after PQ exposure in PQ-poisoned group and curcum in-intervened group(P<0.05 or P<0.01)，and IL-1βlevels in BALF of PQ-poisoned group had increased significantly at3h after PQ exposure(P< 0.01).Compared w ith the PQ-poisoned group,TNF-αand IL-1βlevels in BALF and serum decreased significantly at24 h,3 d,7 d after PQ exposure in curcum in-intervened group(P<0.05 or P<0.01).The levelsof IL-1βand TNF-αwere relevant between BALFand serum in PQ-poisoned group and curcum in-intervened group.Pathological changes of lung tissue weremore serious in PQ-poisoned group than curcumin-intervened group.Conclusion：Neutrophil infiltration in lung tissue,increased releasing of IL-1β and TNF-αin BALF and blood circulation,and then initiating pulmonary and system ic inflammatory responses could be one of the basicmechanisms of PQ-induced acute lung injury in rats.Curcum in could reduce lung injury and system ic inflammatory response to someextentby thissignaling pathway.

R 595.4

A

2095-3496（2015）04-0207-05

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010ZA082）

325000 浙江溫州，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科（陳壽權(quán)，何愛文，李惠萍，李章平，黃唯佳，程俊彥）；江西九江，九江市第一人民醫(yī)院急診科（冷巧云）；廣東珠海，珠海市人民醫(yī)院急診科（劉玉榮）