X射線對嗜熱乳桿菌產L乳酸的選育研究

吳慶華,陳積紅,張 珍,李文建,胡 偉,魏子昊,劉 敬,王曙陽

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室,甘肅蘭州 730000)

吳慶華1,2,3,陳積紅2,3,*,張 珍1,李文建2,3,胡 偉2,3,魏子昊1,劉 敬2,3,王曙陽2,3

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室,甘肅蘭州 730000)

為了獲得更適于工業生產的產L-乳酸菌株,提高生產效率。本文以X射線對嗜熱乳桿菌(Lactobacillusthermophilus)進行誘變處理,通過碳酸鈣-溴甲酚紫平板初篩結合搖瓶復篩的方法,最終獲得穩定高產的突變菌株。結果表明:經X射線誘變得到的突變菌株SR7,平均發酵產酸量為22g/L,比原菌株產量提高了15.04%,且經過多次重復實驗表明該菌株具有良好的遺傳穩定性。

嗜熱乳桿菌,L-乳酸,誘變育種

乳酸(Lactic acid),又名2-羥基丙酸(2-hydroxypropanoic acid),是一種重要的天然有機酸[1]。根據其構型和旋光性,可分為D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸[2]。由于人體只具有L-乳酸脫氫酶,所以只有L-乳酸能被人體完全代謝,而D-乳酸或DL-乳酸的攝入過量則有可能引起代謝紊亂甚至導致中毒[3]。因此,L-乳酸廣泛應用于食品、醫藥、農業、化妝品等領域[4]。特別是高光學純度的L-乳酸,可作為生物降解材料聚乳酸的前體。所以,從健康和環保的角度考慮,L-乳酸的制備及應用研究,已引起世界廣泛重視,應用前景廣闊,市場需求量巨大[5-6]。

目前,在工業上,L-乳酸的生產主要依賴于微生物發酵[7]。其中,細菌類嗜熱乳桿菌屬于同型乳酸發酵菌株,具有發酵溫度高和需氧量低等特點,極大的減少了發酵過程中其他微生物的污染以及生產成本[8]。然而,從自然界中獲得的野生型菌種往往不能達到工業發酵生產要求,需要經過誘變技術進一步人工的改造。如魯明波[9]等人利用紫外線處理鼠李糖乳桿菌,篩選獲得一株比原始菌株產L-乳酸提高了18.1g/L的高產突變株。蔡聰[10]等人通過等離子體誘變凝結芽孢桿菌,篩選得到了穩定高產L-乳酸突變株等。

而X射線作為一種短波長的電磁輻射,具有精度可調,操作簡便等特點,被廣泛應用于生物體的輻照效應研究[11]。例如,羅水忠[12]、陳亮[13]等人都以X射線對菌種進行誘變選育,效果顯著。但該技術在產L-乳酸細菌類中應用很少見報道。

因此,本研究以X射線為誘變手段對嗜熱乳桿菌進行誘變選育,以期望得到穩定高產L-乳酸的突變菌株,降低生產成本,利于工業生產。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

嗜熱乳桿菌(Lactobacillusthermophilus) 由中國科學院近代物理研究所生物物理室提供。

SW-CJ-1Cμ型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TE101-L天平、BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；PB-21酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHP-9082型電熱恒溫箱 上海一恒科學儀器有限公司；旋渦混合器 上海康華生化儀器制造有限公司。

培養基:MRS培養基[14](g/L):葡萄糖20g,蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,檸檬酸鈉5g,吐溫-80 1mL,乙酸鈉5g,K2HPO42g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,pH6.2～6.4(用冰醋酸調pH)；篩選平板(碳酸鈣-溴甲酚紫):MRS培養基中添加0.25%的碳酸鈣和0.01%溴甲酚紫；種子培養基(液體MRS):MRS培養基中不加瓊脂；發酵培養基[15](g/L):種子培養基中葡萄糖50g,CaCO350g,pH6.8。以上培養基滅菌條件均為115℃,20min[16]。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的測定 將斜面保存的嗜熱乳桿菌接種一兩環于種子培養基中,50℃下靜置培養。每2h取樣,測定OD600,至24h。以時間為橫坐標,OD600值為縱坐標作圖,得到原始菌株的生長曲線[17]。

1.2.2 X射線誘變 X射線誘變[17]:取活化后的菌種,用生理鹽水將菌濃度調整到10-8個/mL,用振蕩器制成均勻的菌懸液。將制備好的菌懸液吸取1mL于輻照小皿,輻射計量為0.98Gy/min,以0、12.5、25、50、75、100、125、150Gy下進行X射線輻照。將輻照好的菌懸液進行梯度稀釋,吸取0.1mL涂于篩選平板上,50℃培養24h后計算每皿菌落數,繪制致死曲線。進行突變菌株初步篩選,挑取單菌落進行后期發酵測定實驗。

1.2.3 菌種篩選 初篩:將經X射線誘變處理的菌懸液適當稀釋,吸取0.1mL涂布于篩選平板上,50℃培養24h,篩選平板上將出現乳白色菌落,并且在菌落周圍出現黃色變色圈。將變色圈大的菌落挑取培養,然后稀釋涂布成單菌落,測定變色圈直徑和菌落直徑之比(即HC值),并進行編號[18]。

復篩:挑取初篩菌種的保藏菌種一兩環,在種子培養基中培養到對數后半期后,以10%的接種量轉入發酵培養基,進行復發酵實驗,培養72h進行產量測定。

1.2.4 分析方法 生物量測定:采用比濁法,紫外分光光度計測菌液OD600nm[18]；致死率的測定:活菌平板計數法[19]；乳酸的測定:EDTA滴定法[20]。

致死率(%)=(誘變前活菌數-誘變后活菌數)/誘變前活菌數×100

1.2.5 數據處理方法 數據處理均采用Excel、顯著性結果分析均采用SPSS19；圖表制作均采用origin 7.5。

2 結果與分析

2.1 原始菌株的生長曲線

為了了解原始菌株生長情況并為后期實驗做準備。按照1.2.1的方法,得到原始菌株的生長曲線(圖1)。由圖1可以看出,前10h為延滯期,從10h到22h為對數生長期,22h后為穩定期。由于誘變在菌種生長的對數期后半期效果最明顯,所以選取培養18h的菌種作后期誘變處理。

圖1 嗜熱乳桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus thermophilus

2.2 X射線誘變結果

本實驗將X射線的流強控制在大致相同的范圍內,按照1.2.2的方法,以相對輻照劑量為橫坐標,致死率為縱坐標,作致死曲線,結果如圖2所示。

圖2 嗜熱乳桿菌的致死曲線Fig.2 Lethality rate curve of Lactobacillus thermophilus

根據誘變理論,有研究表明一般選擇致死率為70%～80%的劑量輻照誘變菌株,菌株容易出現正突變[10,18]。由圖2可以看出,隨著輻照劑量的增加,細菌的致死率逐漸提高,當輻照劑量達到75Gy時,致死率已經達到94%。圖2表明,本實驗選取的輻照量范圍合理,并選擇輻照劑量在50～100Gy的菌液平板,挑取單菌落進行發酵測定。

表2 突變株SR3、SR5、SR7遺傳穩定性測定(g/L)Table 2 The results of genetic stability of the mutation stain SR3、SR5、SR7(g/L)

2.3 X射線突變菌的篩選

2.3.1 初篩 將經X射線誘變處理的菌懸液適當稀釋,按照1.2.3初篩的方法,初篩結果見表1。為了實驗的可靠性和重復性,再對其做了發酵產酸測定(圖3)。結果SR7的HC值高于原始的5.4%,發酵產酸也達到了23.35g/L,有顯著差異(p<0.001)。則根據表1和圖3挑選出HC值比出發菌株SR0大并產酸能力強的3株(S3、S5、S7)單菌落挑取保藏,以便進行下一步發酵實驗。

表1 嗜熱乳桿菌的平板初篩Table 1 Screening results ofLactobacillus thermophilus with plate

圖3 菌株的產酸篩選Fig.3 The strains screening of acid production注:不同數量的*表示差異顯著, *p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；圖4、表2同。

2.3.2 復篩 綜上可見,將挑選出的SR3、SR5、SR7突變株進行重復發酵實驗。按照1.2.3復篩的方法,得到突變菌株的產酸如圖4。由圖4可見,SR7突變菌株的產酸量比原始菌株有顯著的提高。

圖4 菌株的產酸篩選Fig.4 The strains screening of acid production

2.4 突變株穩定性測定

將以上3個突變株連續傳代7次,每隔一代分別進行發酵產酸實驗,測定L-乳酸含量,結果見表2。從表2可以看出,SR3和SR5突變株的產酸穩定性不好,而SR7經過7次傳代,L-乳酸產量變化不大,說明突變株SR7有穩定的產酸遺傳特性。原始菌株L-乳酸產量平均為19.12g/L,SR7突變菌株的L-乳酸產量平均為22g/L,比原始菌株產酸率提高了15.04%。

3 結論

本實驗通過對原始菌株SR0進行X射線誘變,經初篩、復篩,篩選得到一株穩定的、高產L-乳酸的嗜熱乳桿菌的突變菌株SR7,其L-乳酸產量從最初的19.12g/L提高到22g/L,產率提高了15.04%,連續傳代7次其L-乳酸產量變化不大,表明該突變菌株具有較好的遺傳穩定性,這為利用該菌進行L-乳酸工業化生產奠定了一定的基礎。

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Breeding study ofLactobacillusThermophilicsinduced by

X-ray forL-lactic acid productionWU Qing-hua1,2,3,CHEN Ji-hong2,3,*,ZHANG Zhen1,LI Wen-jian2,3,HU Wei2,3,WEI Zi-hao1,LIU Jing2,3,WANG Shu-yang2,3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.Engineering Laboratory of Radiation and Mutation Breeding,Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

In order to obtain a lactic acid bacteria strain to more suitable for industrial production and to improve the production efficiency. TheLactobacillusthermophiluswhich irradiated by X-ray were screened by calcium carbonate-bromocresol purple plate and submerged fermentation in shaking flask. The results showed that a stable high-yield mutant strain,named SR7,could produce 22g/L ofL-lactic acid on average with the yield increase of 15.04%,compared to the original strain. It was also proved that SR7 strain had good genetic stability by repeating experiments.

Lactobacillusthermophilus;L-lactic acid;mutation breeding

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.015

2014-04-02

吳慶華(1988-),女,碩士研究生，研究方向:營養與食品衛生學。

*通訊作者:陳積紅(1965-),男,本科,高級工程師,研究方向:輻射微生物選育研究。

科技部農業科技成果轉化資金項目(2013GB24910680)(2012GB24910647)；國家青年基金項目(11305225)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0116-04