BDE-47對人胚腎細胞HEK293的毒理效應及作用機制

曹璐璐，李斐，吳惠豐，趙建民

1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室，煙臺 264003 2. 中國科學院大學，北京 100049

BDE-47對人胚腎細胞HEK293的毒理效應及作用機制

曹璐璐1,2，李斐1,*，吳惠豐1,#，趙建民1

1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室，煙臺 264003 2. 中國科學院大學，北京 100049

2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)是生物體中含量最高且毒性最強的PBDEs之一，有關BDE-47對腎細胞的毒性及其作用機制的研究仍有待補充。選取3個劑量組(低：10-6mol·L-1、中：10-5mol·L-1、高：10-4mol·L-1)及溶劑對照組，研究了BDE-47對人胚腎細胞(HEK293)的細胞凋亡率及活性氧(ROS)水平的影響；并從分子水平對細胞氧化損傷、凋亡相關蛋白(APE1及p53)及凋亡相關基因mRNA (p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)的表達量進行測定。實驗結果顯示：與對照組相比，中、高劑量組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；ROS水平在中劑量組顯著上升(P<0.01)；隨BDE-47濃度的變化，APE1蛋白表達量與細胞ROS水平存在一致性；p53、Bax、Caspase 8 mRNA表達量與BDE-47的濃度間存在劑量-效應關系。結果表明，BDE-47可誘導HEK293細胞凋亡及氧化應激，APE1可能是細胞ROS升高與細胞凋亡間重要的中介因子；BDE-47可以通過影響Caspase 8及線粒體途徑中p53及Bax的表達誘導細胞凋亡。

2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)；人胚腎細胞；細胞凋亡；氧化損傷；p53；Bax

多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類溴代芳香族化合物，現今作為阻燃劑被廣泛應用[1]。由于其難以降解且可遠距離遷移，目前，已經從多種環境介質及生物體中檢測到PBDEs的存在，如土壤、大氣、沉積物、室內空氣、貽貝、魚類、家禽及人體組織、體液等[2-4]。研究者綜合分析了全球已公布的人群監測結果，認為2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(2,2’,4,4’-tetra-bromodiphenyl ether, BDE-47)是與人群關系最密切的PBDEs同系物之一，而且它也是分布最廣、在生物體中含量最高、對人體和動物毒性最強的PBDEs之一[5]。因此，BDE-47對于人體的潛在毒性作用受到了國內外研究者的廣泛關注。體內及體外實驗表明，BDE-47具有神經毒性、肝腎毒性、生殖毒性及內分泌干擾作用[6-13]。圍繞BDE-47細胞毒性的研究工作也已展開。那廣水等[14]研究發現，BDE-47濃度達20 μg·mL-1以上便會對人肝細胞(L02)的增殖造成抑制。此外，有研究報道，一定劑量的BDE-47(>20 μmol·L-1)可引起L02細胞乳酸脫氫酶(LDH)漏出率增加、細胞丙二醛(MDA)含量增加、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)以及超氧化物歧化酶(SOD)活力降低，表明BDE-47可誘導L02細胞出現氧化應激[13]。He等[15]研究發現，BDE-47對于人成神經細胞瘤細胞(SH-SY5Y)存在毒物興奮效應，且不同濃度BDE-47(1、2、4、8 μg·mL-1)暴露細胞24 h后，細胞在8 μg·mL-1表現出明顯的凋亡、氧化應激及DNA損傷現象。Yan等[16]通過研究指出，BDE-47誘導的細胞凋亡現象可能與活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平增高所造成的線粒體功能障礙有關。李晉等[17]則認為，BDE-47導致的細胞周期阻滯與凋亡可能與p53蛋白表達水平增加有關。腎臟是重要的排毒器官，若腎臟細胞受損，很可能影響腎臟功能的正常發揮[18-19]。目前，關于BDE-47的腎細胞毒性的研究尚不充分，且其毒性機制尚不明晰，本實驗以人胚腎細胞(HEK293)為研究對象，采用低、中、高3種劑量BDE-47對其進行暴露，觀察BDE-47對HEK293細胞凋亡及細胞內ROS水平的影響，并從分子水平初步探究這一系列毒理效應的作用機制，為進一步開展BDE-47的毒性作用機制研究提供實驗數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗細胞

HEK293細胞，由煙臺毓璜頂醫院中心實驗室連培文博士贈予。

1.2 儀器與試劑

儀器：SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(上海博迅實業有限公司)；INCO2/108型二氧化碳培養箱(德國Memmert公司)；XDS-1B型倒置生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司)；5804R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；FACSAria流式細胞儀(美國BD公司)；Nanodrop2000微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；MiniVE電泳及轉膜裝置(美國GE公司)。

試劑：BDE-47(純度為99.5%，美國Chem Service公司)；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液(雙抗)以及磷酸鹽溶液(PBS)均購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，純度>99%，美國MP Biomedicals公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA，美國Sigma公司)；TRIzol總RNA提取試劑(日本寶生物工程株式會社)；SYBR Green實時定量PCR試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶-1(APE1)兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司；p53及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗人多克隆抗體購自美國Cloud-clone Corp公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(杭州華安生物技術有限公司)；HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；脫脂奶粉(純度>99%)及聚偏二氟乙烯膜(PVDF)均購自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產分析純，實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

HEK293細胞復蘇后，培養在含10%(體積百分數)胎牛血清、1%(體積百分數)雙抗的DMEM培養基中，培養條件為：37 ℃、5% CO2、相對濕度95%。3～4 d進行傳代，直至細胞達到對數生長期。

1.3.2 BDE-47暴露溶液的配制

稱取適量的BDE-47溶于DMSO制成標準儲備液(0.2 mol·L-1)，于暴露前用DMEM培養基稀釋成不同濃度的BDE-47暴露溶液，溶劑對照組則向培養基中加入等量的DMSO，各濃度組中DMSO的終濃度為0.1%(體積百分數)。

1.3.3 細胞暴露及收集

結合以往研究[15, 20-23]，BDE-47暴露濃度共分4組，即溶劑對照組和低、中、高劑量組(10-6、10-5、10-4mol·L-1)，每組設3個平行樣。將處于對數生長期細胞接種于直徑為10 cm的培養皿中，接種密度約為105個·mL-1，當細胞融合度達到80%時，吸棄上清培養液，加入不同濃度BDE-47暴露溶液；經24 h暴露培養后吸棄上清溶液，用胰蛋白酶消化細胞2 min，加胎牛血清終止消化后加入PBS吹打洗滌細胞2次，離心收集細胞團塊于1.5 mL離心管中，進行相關指標檢測。

1.3.4 細胞凋亡及ROS水平檢測

細胞凋亡：經暴露收集后，取約1×105個細胞，加入500 μL凋亡試劑盒緩沖液使其重懸；將5 μL Annexin V-FITC加入細胞懸液中，混勻，室溫(18～20 ℃)避光孵育5 min；之后加入5 μL碘化丙啶(PI)混勻，再次室溫避光孵育5 min。使用流式細胞儀于500 nm激發波長和530 nm發射波長下檢測，計數1×104個細胞，用Cell Quest軟件獲取數據并分析細胞凋亡率。

細胞內ROS水平：經暴露收集后，取約1×105個細胞，加入500 μL PBS緩沖液使其重懸；向細胞懸液中加入5×10-4mol·L-1的DCFH-DA溶液5 μL，混勻，18 ℃避光孵育1 h。使用流式細胞儀測定細胞內DCFH熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.3.5 細胞內APE1及p53蛋白的表達量檢測

選取與細胞氧化應激及細胞凋亡有關的2個分子標記蛋白APE1及p53，采用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測BDE-47對這些蛋白表達量的影響。細胞經暴露收集，加入200 μL預冷的細胞裂解液吹打混勻，4 ℃裂解20 min后，經14 000×g離心10 min，吸取上清液；使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并調整各組蛋白濃度一致，按體積比例(蛋白∶上樣緩沖液 = 7∶1)加入十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液后，煮沸變性10 min，室溫冷卻后，4 ℃保存備用。蛋白上樣量為每孔50 μg，采用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并通過電轉將蛋白轉移至PVDF膜上；PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入5 mL目的蛋白及內參蛋白(GAPDH)的一抗稀釋液(APE1一抗稀釋比例為1∶1 000，p53為1∶500，GAPDH為1∶2 000)，4 ℃過夜。次日，用含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液(PBST)漂洗PVDF膜3次，每次10 min；加入含HRP標記的羊抗兔IgG二抗的PBST緩沖液，室溫孵育1 h，再用PBST緩沖液漂洗PVDF膜3次；使用HRP-DAB底物顯色試劑盒孵育10 min顯色，掃描后用凝膠定量分析軟件(Gel-Pro Analyzer，Version 3.0)對蛋白結果進行分析。采用目的條帶與內參條帶灰度值的比值作為結果，將對照組的值設為1，其余各組以相對倍數表示。

1.3.6 細胞凋亡相關基因的轉錄水平表達量檢測

采用實時熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測BDE-47對細胞凋亡相關基因mRNA表達量的影響。細胞經暴露收集，利用TRIzol法提取總RNA，采用微量紫外分光光度計測定總RNA質量，A260/280在1.8～2.0為宜；總RNA經70 ℃熱變性5 min后，通過反轉錄獲取cDNA，反應條件為：42 ℃，1 h；95 ℃，5 min。以SYBR Green作為染料，經實時熒光定量PCR儀，采用兩步法進行PCR擴增，所得數據采用2-ΔΔCT分析法進行相對定量分析。目的基因及內參基因(HPRT1)的引物序列見表1。

1.4 數據整理與統計分析

采用SPSS 16.0統計分析軟件，對各組實驗數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性檢測采用最小顯著差數法(LSD)，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 BDE-47暴露對HEK293細胞凋亡及ROS水平的影響

細胞凋亡率及ROS水平如表2所示。與對照組相比，中、高劑量組細胞凋亡率顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。中劑量組細胞內的ROS水平顯著高于對照組(P<0.01)，而在高劑量組中，ROS含量則顯著降低(P<0.01)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

表2 BDE-47對HEK293細胞凋亡率及ROS(活性氧)水平的影響Table 2 Effects of BDE-47 on HEK293 cells apoptosis and ROS (reactive oxygen species) level

注：與溶劑對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Notes: The level of significance is set at*P<0.05,**P<0.01 vs. control.

2.2 BDE-47暴露對HEK293細胞中APE1及p53蛋白表達水平的影響 BDE-47暴露對HEK293細胞氧化應激及細胞凋亡途徑產生影響，并且與濃度相關。由圖1中可以看出，相比對照組，APE1僅在中劑量組表達量較對照組顯著升高(P<0.01)；而p53蛋白的表達量隨濃度的升高表現出先增加后減少的現象(P<0.05)。2.3 BDE-47暴露對HEK293細胞凋亡相關基因轉錄水平的影響

BDE-47對凋亡相關基因mRNA表達量的影響如表3所示。與對照組相比，Caspase 3 mRNA表達水平并未隨BDE-47濃度而產生明顯變化，而其他基因的mRNA表達量隨BDE-47濃度的升高而逐漸增加。Bax mRNA的表達水平在高劑量組中明顯升高(P<0.05)；而p53 mRNA的表達量在中、高劑量組均顯著增加(P<0.05)；此外，Caspase 8 mRNA在高劑量組的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

細胞凋亡是由基因調控的細胞自主程序性死亡，用以保障生命的穩定性[24]。誘導細胞凋亡的信號通路復雜多樣，而ROS作為細胞凋亡相關信號通路的重要參與者，亦引起了國內外學者的廣泛研究[13,15-16]。本實驗結果顯示，在BDE-47中劑量組中，細胞凋亡率與細胞內ROS水平均有所上升。結合以往研究成果[15]，推測BDE-47暴露使HEK293細胞內ROS水平升高，導致DNA損傷，進而誘發細胞凋亡現象。而高劑量的BDE-47使細胞凋亡增加，但細胞內ROS水平顯著降低，這可能由于過高劑量的BDE-47造成大量細胞死亡并形成細胞碎片，造成細胞內ROS無法被檢測。

圖1 BDE-47對HEK293細胞中APE1及p53 蛋白表達水平的影響注：圖中1為溶劑對照組(0.1% DMSO)，2為低劑量 組(10-6 mol·L-1)，3為中劑量組(10-5 mol·L-1)，4為高劑 量組(10-4 mol·L-1)；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 1 Effects of BDE-47 on proteins (APE1 and p53) expression level in HEK293 cells Notes: 1 is control group (0.1% DMSO), 2 is low concentration group (10-6 mol·L-1), 3 is medium concentration group (10-5 mol·L-1) and 4 is high concentration group (10-4 mol·L-1). The level of significance is set at *P<0.05, **P<0.01 vs. control.

表3 BDE-47對HEK293細胞中凋亡相關基因mRNA表達量的影響Table 3 Effects of BDE-47 on apoptosis-related genes mRNA expression level in HEK293 cells

注：與溶劑對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Notes: The level of significance is set at*P<0.05,**P<0.01 vs. control.

結合細胞水平的毒理效應表現，從分子水平進一步研究了BDE-47對細胞氧化應激及凋亡相關的兩個蛋白(APE1及p53)表達量的影響及對細胞凋亡相關基因(p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)轉錄水平的影響，以系統闡明BDE-47對HEK293細胞的毒性作用機制。APE1作為重要的氧化還原因子，可以通過改變半胱氨酸殘基在DNA中的定位，激活受控轉錄因子而發揮重要的生理作用，這些轉錄因子涉及細胞增殖、分化和凋亡等重要細胞效應[25]。已有研究指出，APE1在細胞中受ROS調控，氧化應激狀態的細胞中APE1表達量明顯增加[26]。在本實驗中，APE1蛋白的表達量與細胞內ROS水平在不同的劑量組中存在一致性，推測細胞內ROS水平的上升造成APE1表達量上調。此外，隨細胞功能狀態的不同，APE1既可發揮抑制凋亡的作用又可發揮促凋亡作用。其促凋亡機制主要通過激活下游的轉錄因子AP-1及p53蛋白介導凋亡[27-28]。本實驗中，中劑量組同時檢測到APE1、p53蛋白表達量的上調與細胞凋亡率的上升，推測APE1的高表達可能促進p53依賴的細胞凋亡。

p53是重要的細胞周期與細胞凋亡的調控者，當外源污染物刺激或內源ROS升高導致細胞DNA損傷無法修復時，p53可通過多種途徑誘導細胞凋亡[29]；Bax作為Bcl-2家族成員之一，具有促凋亡作用，其基因啟動子區域有p53的結合位點，所以p53能夠促進Bax的表達[30]。已有研究指出，在1～10 μmol·L-1范圍內，SH-SY5Y細胞中p53及BaxmRNA表達量與BDE-47劑量呈現正向劑量效應關系[31]，本實驗在10-6～10-4mol·L-1檢測到相似現象，推測BDE-47暴露使HEK293細胞內p53水平上調，進而促進Bax的表達，Bax轉移至線粒體與Bcl-2家族成員協同調節使通透性轉換孔(PTP)開放，造成線粒體中凋亡相關因子(細胞色素c或凋亡誘導因子AIF等)被釋放至胞質中，激活下游凋亡因子，誘導細胞凋亡[32-33]。p53蛋白與mRNA在高劑量組的表達水平存在差異，推測為翻譯后修飾的結果。Caspase家族是凋亡的主要參與者，Caspase 8屬于凋亡啟動因子，位于凋亡級聯效應的頂端，幾乎可以激活所有下游的Caspase[34]；同時，Caspase 8也可以啟動線粒體凋亡途徑，其可將Bid (Bcl-2家族促凋亡因子)剪切為tBid，tBid轉移定位于線粒體，與Bcl-2家族其他成員共同作用促使凋亡的進行[35-36]。已有研究指出，一定劑量(5、10 μmol·L-1)的BDE-47可導致SH-SY5Y細胞中Caspase 8 mRNA表達量上調[37]，與本實驗結果具有一致性，說明外源死亡受體途徑激活Caspase 8后，其可能通過Caspase家族的凋亡級聯效應或線粒體途徑參與HEK293的細胞凋亡過程。線粒體除釋放細胞色素c激活Caspase依賴的凋亡途徑外，還可通過釋放AIF等啟動非Caspase依賴的凋亡途徑[38]。凋亡執行因子Caspase3 mRNA表達量在各劑量組中均無明顯變化，指示HEK293細胞在凋亡最后的執行階段，可能通過Caspase家族其他凋亡執行因子(Caspase 6及Caspase 7)或非Caspase依賴的途徑實現細胞凋亡。

綜上所述，一定劑量的BDE-47可誘導HEK293細胞凋亡產生ROS；結合翻譯水平及轉錄水平結果推測：ROS的產生可誘導APE1的上調，進而激活下游轉錄因子p53；p53可促使Bax高表達并轉移至線粒體，造成其中凋亡相關因子的釋放；Caspase 8可啟動HEK293細胞凋亡，但其是否通過線粒體途徑介導凋亡仍有待進一步研究。本實驗揭示了BDE-47對HEK293細胞的毒理效應，并初步探究了效應機制，為BDE-47的腎細胞毒理效應研究提供了理論支持。

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The Toxicological Effects and Mechanisms of BDE-47 on HEK293 Cells

Cao Lulu1,2, Li Fei1,*, Wu Huifeng1,#, Zhao Jianmin1

1. Key Laboratory of Coastal Environmental Processes and Ecological Remediation of Chinese Academy of Sciences, Yantai Institute of Coastal Zone Research (YIC), Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

5 December 2014 accepted 5 January 2015

Three BDE-47 concentration groups (low: 10-6mol·L-1, medium: 10-5mol·L-1, high: 10-4mol·L-1) and one control group were chosen to investigate the toxic effects of BDE-47 on HEK293 cells, including cell apoptosis ratio and ROS level. Furthermore, the abundance of several proteins (APE1 and p53) and expression level of p53, Bax, Caspase 8 were also detected at molecular level. It was found that cell apoptosis was significantly increased in the medium and high concentration groups (P<0.05) compared with the control. ROS level also increased significantly in the medium concentration group (P<0.01). With the increase of BDE-47 concentrations, the variation trend of APE1 abundance was coincident with that of ROS level. Moreover, the mRNA expression level of apoptosis-related genes (p53, Bax and Caspase 8) was up-regulated with the increase of BDE-47 concentrations. These results showed that BDE-47 could cause several toxic effects on HEK293 cells, including induction of cell apoptosis and oxidative stress. APE1 was perhaps an important mediator of cell apoptosis and oxidative stress. BDE-47 could induce cell apoptosis by affecting the expression of Caspase 8 and p53, Bax through the mitochondria signal pathway.

BDE-47; HEK293; cell apoptosis; oxidative damage; p53; Bax

國家自然科學基金(21107136)；國際科學基金(F/5230-1); 中國科學院重點部署項目(KZZD-EW-14); 中國科學院戰略性先導科技專項(A類)(XDA11020405)

曹璐璐(1989-)，女，學士，研究方向為海洋生態毒理，E-mail: llcao1026@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: fli@yic.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141205002

2014-12-05 錄用日期：2015-01-05

1673-5897(2015)2-236-07

X171.5

A

李斐(1982-)，女，工學博士，助理研究員，主要從事生態毒理與計算毒理學方面的研究。

吳惠豐(1977-)，男，理學博士，研究員，主要從事海洋生態毒理方面的研究。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail: hfwu@yic.ac.cn

曹璐璐, 李斐, 吳惠豐. BDE-47對人胚腎細胞HEK293的毒理效應及作用機制[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 236-242

Cao L L, Li F, Wu H F. The toxicological effects and mechanisms of BDE-47 on HEK293 cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 236-242 (in Chinese)