雙相障礙患者HPA軸改變與血清蛋白表達(dá)譜差異研究*

程宇航 謝靜 何山 田玉潔 馬征 李文標(biāo)

·論著·

雙相障礙患者HPA軸改變與血清蛋白表達(dá)譜差異研究*

程宇航1謝靜2何山1田玉潔1馬征1李文標(biāo)1

目的 探討雙相情感障礙（BD）患者丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）功能改變的血清蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。方法選取57例BD患者，根據(jù)有無HPA軸改變分為異常雙相障礙組（異常組，22例）和正常雙相障礙組（正常組，35例），采用弱陽離子交換（WCX）納米磁珠捕獲血清蛋白質(zhì)組分，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)譜。結(jié)果異常組患者血清差異蛋白分子降低，在異常組與正常組之間篩選20個(gè)差異表達(dá)蛋白分子（P＜0.05），8個(gè)差異蛋白峰為異常組患者特有表達(dá)。以質(zhì)荷比為M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9的分子建立了診斷模型，其敏感性和特異性分別為86.4%和94.3%。結(jié)論雙相障礙患者HPA軸功能異常，導(dǎo)致血清差異蛋白表達(dá)異常，可能有其特征性病理機(jī)制。

雙相情感障礙 HPA 生物標(biāo)志物 蛋白質(zhì)組學(xué) 磁珠 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

雙相障礙（Bipolar Disorder，BD）是一種慢性復(fù)發(fā)性精神疾病，已具有某些躁狂和抑郁發(fā)作期為特征。是情感性精神障礙的一個(gè)亞型。該疾病預(yù)后不良，復(fù)發(fā)率、自殺率和自殘率均很高，是一種嚴(yán)重的精神疾病。雙相障礙病因尚未明確，可能與遺傳因素、生物學(xué)因素和心理社會(huì)因素關(guān)系密切。多數(shù)研究顯示雙相障礙和神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)有關(guān)，包括下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT），其中，HPA軸功能失調(diào)是主要標(biāo)志，包括中樞促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）分泌增多，精氨酸加壓素的分泌異常，外周血皮質(zhì)醇（CORT）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的含量升高等［1，2］。HPA軸功能亢進(jìn)可能導(dǎo)致HPT軸功能缺失［3］，情感障礙神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂的確切機(jī)制目前還不是很清楚，受到檢測(cè)技術(shù)手段的限制，臨床上尚缺乏可靠的生物學(xué)診斷指標(biāo)支持。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種重要的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在許多疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究上發(fā)揮著非常重要的作用，已用于多種疾病的生物標(biāo)志物探索及早期診斷［4～6］。前期，我們采用WCX納米磁珠結(jié)合蛋白芯片閱讀儀聯(lián)用的蛋白指紋圖譜技術(shù)，對(duì)雙相障礙患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行初步研究，獲得了與其他精神疾病有顯著差異的蛋白質(zhì)譜［7］，為情感障礙亞型特異性提供了生物學(xué)依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)HPA軸異常與正常的雙相障礙患者血清差異蛋白進(jìn)行分析，尋找有意義的差異蛋白譜峰，建立HPA軸異常的情感障礙患者血清蛋白診斷模型，為篩選情感障礙患者血清生物標(biāo)志物提供一種新的途徑。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2012年～2013年在北京安定醫(yī)院住院的雙相情感障礙患者。共57例，其中男27例，女30例；年齡18～50歲；病程3個(gè)月～12年，中位數(shù)為2.2年。依據(jù)國(guó)際疾病分類第十版（ICD-10）診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診入組雙相情感障礙患者。近期內(nèi)未使用激素及免疫調(diào)節(jié)劑，入組前1個(gè)月未服用抗精神病藥物。患者無酒精依賴史、中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變及心肝腎功能不全等重大軀體疾病史。分組標(biāo)準(zhǔn)：異常雙相情感障礙組（異常組）22例（其中男10例，女12例），促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及皮質(zhì)酮（CORT）檢測(cè)值有1項(xiàng)及以上異常者；正常雙相情感障礙組（正常組）35例（其中男17例，女18例），ACTH及CORT檢測(cè)值均在正常參考范圍；ACTH參考范圍0～37 pg／m l、CORT參考范圍5～25μg／dl（AM）［8］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 （1）血清標(biāo)本采集：于上午6～8點(diǎn)空腹采集患者全血5m l，置于真空負(fù)壓管中，不加抗凝劑，室溫靜置1 h，2 000 g離心20 min，取上清液。分裝在500μl的EP管中，－80℃冰箱保存。所有血清樣本直至進(jìn)行MALDI-TOF-MS前進(jìn)行解凍。（2）血漿標(biāo)本采集：于上午6～8點(diǎn)空腹采集患者全血3 m l，置于EDTA-3K抗凝管中，離心1 500 g／min，5 min，取血漿，置－80℃冰箱保存批量檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定

1.2.2.1 ACTH及CORT測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，ACTH應(yīng)用順序免疫度量實(shí)驗(yàn)，CORT采用競(jìng)爭(zhēng)法，由天津德普生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司提供檢測(cè)試劑盒，測(cè)定儀器為IMMULITE 1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)DPC公司）。測(cè)定ACTH、CORT的批內(nèi)變異系數(shù)均＜10%。

1.2.2.2 血清蛋白質(zhì)譜分析 （1）制備樣本：從－80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10 000 rpm離心20 min。取上清10μl與20μl的U9緩沖液（9 mol／L Urea，20 g／L CHAPS，10 g／L DTT，50 mmol Tris-HCl，pH9.0）混合。4℃振蕩孵育30 min后，加入100 mmol／L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）370μl。（2）WCX納米磁珠的活化：取WCX納米磁珠混懸液50μl，用100μl醋酸鈉緩沖液洗滌磁珠2次，5 min／次。（3）采用WCX納米磁珠捕獲血清蛋白：將100μl處理好的血清樣品加入活化的磁珠中，振蕩孵育1 h。放置在磁性分離板上2 min，棄上清液。加入100μl醋酸鈉緩沖液洗滌2次，5 min／次。用10μl0.5%（v／v）的TFA洗脫磁珠5 min。取5μl洗脫液與等量的SPA溶液充分混合，吸取2μl混合物進(jìn)行點(diǎn)樣，室溫下自然干燥，用PBSⅡ-c型MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀（購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）檢測(cè)血清蛋白組分，并繪制蛋白質(zhì)指紋圖譜。（4）芯片質(zhì)控和重復(fù)性：每個(gè)芯片在實(shí)驗(yàn)過程中均隨機(jī)加入1個(gè)血清質(zhì)控樣品（質(zhì)控品由北京德易臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心提供），蛋白質(zhì)峰平均CV＜15%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用BioMarker Wizard 3.1軟件及SPSS16.0軟件對(duì)芯片檢測(cè)得到的蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。異常組與正常組之間的差異蛋白峰比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上述數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用Biomarker Patterns S of tware 5.0（BPS）分析HPA軸異常情感障礙的生物標(biāo)志物，并建立分類樹模型。

2 結(jié)果

2.1 兩組蛋白指紋圖譜比較 檢測(cè)57例BD樣本，得到114個(gè)蛋白峰，有20個(gè)蛋白峰有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 篩選出的20個(gè)P＜0.05的差異蛋白分子（±s）

表1 篩選出的20個(gè)P＜0.05的差異蛋白分子（±s）

注：*為僅在異常組中檢出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

M／Z異常組（n＝22）正常組（n＝35）t值P值M1147.07*4.23±2.82 2.62±1.64 2.159 0.042 M3326.41 2.26±2.41 4.04±3.01－2.080 0.043 M3827.15*4.50±2.92 3.08±1.81 2.049 0.046 M3899.39 5.08±4.66 8.32±4.94－2.199 0.033 M4166.52*0.97±1.10 2.96±3.45－2.915 0.006 M4486.08 6.01±4.93 16.30±10.44－4.571 0.000 M4804.58 4.90±3.85 7.77±4.64－2.274 0.029 M5929.00 20.15±11.73 31.16±17.28－2.590 0.013 M6445.62 9.52±11.38 21.20±15.27－2.747 0.009 M6643.63 20.93±18.88 38.41±16.68－3.291 0.002 M6861.00*1.95±1.81 5.06±3.82－3.777 0.000 M7793.51 12.02±9.40 24.13±18.65－2.955 0.005 M7942.19 3.26±3.03 8.17±7.24－3.249 0.002 M8355.33 0.77±0.82 1.42±1.18－2.215 0.032 M8716.21*21.78±18.05 32.51±17.14－2.022 0.049 M8941.33*2.67±3.35 6.43±4.91－3.103 0.003 M8967.17*1.20±1.10 2.82±2.50－3.103 0.003 M10847.9 0.53±0.49 1.19±0.59－3.923 0.000 M11708.0*1.50±1.05 2.23±1.18－2.129 0.039 M24041.8 2.80±2.07 4.43±2.79－2.098 0.042

圖1 異常組與正常組患者的部分蛋白的典型圖譜

圖2 區(qū)分BD患者HPA軸異常的決策樹

2.2 BD患者HPA軸異常血清蛋白標(biāo)志物的篩選及診斷模型的建立 從20個(gè)差異蛋白分子中篩選出方差齊且P＜0.01的10個(gè)差異蛋白分子導(dǎo)入BioMarker Patterns S of tware Version 5.0（BPS）分析軟件，篩選出M／Z為M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9蛋白峰為診斷HPA軸異常雙相障礙的最佳標(biāo)志物（圖1）。以這4個(gè)差異蛋白建立了分類樹模型（圖2），敏感性86.4%，特異性94.3%，當(dāng)滿足蛋白峰強(qiáng)度M10847.9≤0.708291且M4166.52≤1.29514進(jìn)入終節(jié)點(diǎn)1或M10847.9＞0.708291且M6861.00≤4.31954且M6643.63＞49.529進(jìn)入終節(jié)點(diǎn)4時(shí)，則模型判斷為HPA軸異常的BD。以敏感性為縱座標(biāo)，1-特異性為橫坐標(biāo)，繪制ROC曲線圖，曲線下的面積（AUC）為0.948，見圖3。

圖3 HPA軸異常BD診斷模型的ROC曲線

3 討論

下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)的重要軸路之一，其功能的變化直接影響著機(jī)體的健康狀況，由各類應(yīng)激因素引起的HPA軸功能紊亂，主要表現(xiàn)為HPA軸功能的亢進(jìn)。近年研究表明，HPA軸亢進(jìn)是導(dǎo)致糖尿病和抑郁癥等多種疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一［9，10］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HPA軸異常的情感障礙患者病情有可能更重，HPA系統(tǒng)功能恢復(fù)與患者的療效及預(yù)后密切相關(guān)［11，12］。關(guān)于HPA軸功能亢進(jìn)的血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征，目前沒有研究報(bào)告。本研究中，我們采用MALDITOF-MS和WCX納米磁珠聯(lián)用的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測(cè)了57例雙相情感障礙患者的血清低分子量蛋白指紋圖譜。各樣品的質(zhì)譜范圍均顯示在2～20 kD之間。表明WCX磁珠對(duì)pH為4.5狀態(tài)下血清中帶正電荷的低分子量蛋白具有較好的捕獲能力。對(duì)可檢測(cè)到的114個(gè)蛋白峰的統(tǒng)計(jì)分析顯示，異常組較正常組的患者間有20個(gè)蛋白峰存在顯著性差異（P＜0.05），其中有10個(gè)差異蛋白表達(dá)下降（P＜0.01），而且異常組患者有特征性差異蛋白峰，它們是M1147.06、M3827.15、M4166.52、M6861.00、M8716.21、M8941.33、M8967.17、M11708.00。這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)也沒有在我們已經(jīng)報(bào)道的正常人和其他精神疾病中發(fā)現(xiàn)［7］。表明這部分患者有不同于其他類型精神疾病的生物學(xué)特征，進(jìn)一步追蹤這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的變化可能有助于了解雙相情感障礙的病理過程。Stelzhammer V等［13］研究了雙相障礙與重癥抑郁癥死后腦垂體蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)BD患者有大量阿片黑素促皮質(zhì)激素原（POMC）和甘丙肽表達(dá)。POMC是垂體多種激素的前體，垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞將POMC處理成ACTH和β-促脂素。推斷垂體POMC的大量表達(dá)導(dǎo)致ACTH和CORT分泌增加，可能是雙相障礙患者HPA軸功能紊亂的病理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)外周血ACTH和CORT表達(dá)增高的雙相障礙患者，表現(xiàn)出特征性的血清蛋白差異表達(dá)譜，推測(cè)HPA軸功能紊亂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)代謝發(fā)生障礙，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持下丘腦-垂體-腎上腺軸參與了雙相情感障礙發(fā)病機(jī)制，其蛋白表達(dá)之間的相互作用應(yīng)該是有前途的研究方向之一。

本研究發(fā)現(xiàn)雙相情感障礙患者HPA軸異常血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，但因這些蛋白屬低豐度蛋白，現(xiàn)有方法學(xué)分離和鑒定十分困難［14］，故沒有進(jìn)行鑒定。然而，正是這些低豐度蛋白帶給研究者十分重要的信息，研究者嘗試以4個(gè)差異蛋白分子構(gòu)成的診斷模型（圖2），其敏感性為86.4%，特異性為94.3%，ROC曲線顯示AUC在0.9以上具有較高的準(zhǔn)確性，說明診斷效果較好。其臨床應(yīng)用價(jià)值有待于大樣本量的盲法驗(yàn)證、評(píng)估與修正。

［1］Pariante CM，Lightman SL.The HPA axis inmajor depression：classical theories and new developments［J］.Trends Neurosci，2008，31（9）：464－468

［2］程宇航，何山，王敏玲，等.抑郁癥患者血漿精氨酸加壓素與促腎上腺皮質(zhì)激素增高的關(guān)系［J］.臨床精神醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（4）：258－260

［3］Duval F，Mokram i MC，Monreal-Ortiz JA，ea al.Cortisol hypersecretion in unipolarmajor depression withmelancholic and psychotic features：dopaminergic，noradrenergic and thyroid correlates［J］.Psychoneuroendocrinology，2007，32（2）：211－212

［4］Bruchmuller K，Meyer TD，Diagnostically irrelevant information can affect the likelihood of a diagnosis of bipolar disorder［J］.J Affect Disord，2009，116（1－2）：148－151

［5］Andreazza AC.Combining redox-proteomics and epigenomics to explain the involvement of oxidative stress in psychiatric disorders［J］Mol BioSyst，2012，8（10）：2503－2512

［6］Alsaif M，Guest PC，Schwarz E，et al.Analysis of serum and plasma identifies differences in molecular coverage，measurement variability，and candidate biomarker selection［J］.Proteomics Clin Appl，2012，6（5－6）：297－303.

［7］程宇航，謝靜，劉瑞玫，等.應(yīng)用納米磁珠聯(lián)合MALDITOF-MS技術(shù)對(duì)雙相情感障礙患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究［J］.精神醫(yī)學(xué)雜志，2011，24（6）：405－410

［8］周新，涂植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：297

［9］Fel??ciM，Schroner Z，PetroviˇcováJ，et al.Relationship between type 2 diabetes mellitus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis［J］.Wien Klin Wochenschr，2011，123（1－2）：28－33

［10］Viinamki H，Lehto SM，Palvimo JJ，etal.Glucocorticoids and aetiopathogenesis of depression［J］.Duodecim，2012，128（10）：1022－1029

［11］Ising M，Horstmann S，Kloiber S，et al.Combined dexamethasone／corticotropin releasing hormone test predicts treatment response in major depression-a potential biomarker［J］.J Biol Psychiatry，2007，62（1）：47－54

［12］Gracia R.Stress，metaplasticity，and antidepressants［J］. Curr Mol Med，2002，2（7）：629－638

［13］Stelzhammer V，Alsaif M，Chan MK，et al.Distinct proteomic pr of iles in post-mortem pituitary glands from bipolar disorder and major depressive disorder patients［J］.J Psychiatr Res，2015，60：40－48

［14］Shen H，Cheng G，F(xiàn)an H，et al.Expressed proteome analysis of human hepatocellular carcinoma in nude mice（LCI-D20）with high metastasis potential［J］.Proteomics，2006，6（2）：528－537

A study of the differences between serum protein expression profile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder．

CHENG Yuhang，XIE Jing，HE Shan，et al．
Beijing Anding Hospital，Capital Medical University，Beijing 100088，China

Objective To explore the differences between serum protein expression pr of ile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder（BD）.MethodAtotal of 57 patientswith BD were divided into exception group（22 cases）and normal group（35 cases）according to exception or normal function of HPA in the patients.The serum of two groupswas tested with weak cationic exchange（WCX）magnetic beads for constituents of serum protein and Martrix-Assisted Laser Desorption／lionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF-MS）for the proteomics.ResultsThere were differences for 20 protein biomarker peaks between exception group and normal group（P＜0.05）and specific expressions for 8 protein biomarker peakswere found in exception group.The diagnosticmodelwas established based on thesemoleculeswith the mass-to-charge ratio of M4166.52，M6643.63，M6861 and M10847.9；it was 86.4%for the sensitivity and 94.3%for the specificity.ConclusionThere are some correlations between the dysfunction of HPA and the dysfunction of serum protein expression in patientswith BD and theremay be characteristic pathologicalmechanism between them.

Bipolar disorder Hypothalamus-pituitary-adrenal Biomarkers Proteomics Magnetic beads Martrix-assisted laser desorption／lionization time of flightmass spectrometry（MALDI-TOF-MS）

R749.4

A

2095－9346（2015）－06－0401－05

10.3969／j.issn.2095－9346.2015.06.001

2015－08－16）

首都衛(wèi)生發(fā)展專項(xiàng)基金（編號(hào)：首發(fā)2011-2012-04）

1.100088 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院 2.中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院