硫化氫對大鼠局灶性腦缺血損傷的影響

孫立新 李國風 駱海坤 張勤增 解麗君 姜紅 李立萍 郝娜 張建新

腦卒中是導致疾病和死亡的一個重要因素，現已成為繼心血管疾病和癌癥的第三大死亡原因。腦卒中分為缺血性腦卒中和出性腦卒中兩種類型，其中大約80%以上的腦卒中由缺血引起。缺血性腦卒中的發病原因為腦部某動脈供血區的血流因栓塞或出血而暫時或永久地減少導致的腦組織缺血。目前，關于缺血性腦卒中的發病機制正在逐步深入研究［1］。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，然而近年來的研究發現，H2S廣泛參與機體的多種病理和生理過程，被認為是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第三種氣體信號分子［2］。研究證實H2S參與了腦缺血性損傷的發生，并認為神經系統內產生H2S的主要酶是胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸轉硫酶(3-mercaptopyruvat sulfur transferase，3MST)，并進一步證實3MST是中樞神經系統生成H2S的重要酶［3－5］，但對于局灶性腦缺血損傷和H2S/3MST的關系以及H2S對腦缺血損傷的影響報道較少，本研究擬采用復制局灶性腦缺血大鼠模型，觀察H2S對局灶性腦缺血損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 NaHS，2，3，5-三苯基四氮唑蘭(TTC)，美國Sigma公司;考馬斯亮蘭試劑盒，南京建成生物工程研究所;α-酮戊二酸，上海試劑三廠;電動勻漿器Silentcrusher M，德國Eppendorf公司;分析天平梅特勒-AE240，瑞士梅特勒公司;全波長酶標儀，美國BIOTEK公司;722分光光度計，上海市第三分析儀器廠;恒溫干燥箱，日本SANYO公司;SHA-C恒溫水浴振蕩器，常州市國華電器有限公司。

1.2 實驗動物及分組 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體重250～280 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為5組，每組16只，分別為假手術組;缺血模型組;NaHS低劑量組(L-NaHS);NaHS中劑量組(M-NaHS);NaHS高劑量組(H-NaHS)。NaHS低、中、高劑量組分別于大鼠腦缺血3 h 時腹腔注射0.7、1.4 和2.8 mg/kg的 NaHS，假手術組和缺血模型組注射等容量的0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠均于缺血24 h斷頭取腦，TTC染色測定腦梗死體積，測定腦組織中H2S含量，改良法測定腦組織3MST的活性。

1.3 大鼠局灶性腦缺血模型制備 大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，消毒頸前區皮膚，取頸正中切口，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，用電熱燒灼器將頸外動脈的分支燒斷，結扎并游離頸外動脈主干一段，在頸外動脈游離段上剪開一小口，將預先制備好的尼龍線栓子插入，經頸總動脈分支處通過頸內動脈入顱，至大腦前動脈首端，尼龍線插入深度平均為(18.5±0.5)mm。以插入尼龍線栓子作為缺血記時的開始，動物蘇醒后，出現霍納(Horner)綜合征:左側眼裂變小并右側偏癱，以右上肢更為明顯;提尾懸拉后出現右上肢蜷縮屈曲;下地不能直行，向右側轉圈跌倒，挑選手術成功、符合上述標準的大鼠進行實驗。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 腦梗死體積測定:按實驗設計規定的時間處死動物，迅速取出大腦，置－20℃冰箱中冷凍30 min，從前向后切成1.5mm厚度的腦片，置0.5%TTC染液中，37℃孵育15 min。取出腦片后置10%的甲醛溶液中固定，在3d內取出照相，用PhotoshopCS2軟件對圖像進行處理并計算腦缺血體積。為減少大鼠個體差異、腦水腫和照相等因素對缺血體積檢測的影響，對每只大鼠以梗死缺血體積/全腦體積(IV%)作統計計算。

1.4.2 腦組織中H2S含量的測定:采用去蛋白的方法測定［4］，用不同濃度的NaHS繪制標準曲線。在不同時間點處死大鼠開顱取腦，分離出缺血側腦組織，放入液氮保存備用。用0～4℃的50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.4)制備勻漿(質量體積比為12%)，勻漿液離心(47000 ×g，10 min，4℃)，取 75 μl上清液移至另一離心管中，在室溫下加入0.25 ml的1%醋酸鋅及0.45 ml蒸餾水孵育10 min，然后加入10%三氯乙酸0.25 ml再次離心(14000 ×g，10 min，4℃)，收集清澈的上清液，加入133 μl的N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽(20mmol/L)/HCl(7.2 mol/L)緩沖液及 133 μl的 FeCl3(30mmol/L)/HCl(1.2 mol/L)緩沖液，充分混勻。20 min后，用全自動酶標儀(Bio-TEK ELx800，美國)在波長670 nm測定吸光度，根據不同濃度NaHS繪制的標準曲線計算溶液中的H2S含量，以單位重量的腦組織中H2S的量(nmol/g)表示。

1.4.3 腦組織中3MST活性的測定:參照Qu、Kimura等的方法并改良［4，5］。反應在25 ml錐形瓶中進行，反應體積1 ml含50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.4)0.5 ml、10mmol/L 的 L-半胱氨酸 0.1 ml、5mmol/L 的α-酮戊二酸 0.1 ml和 12%(W/V)腦組織勻漿0.3 ml。在中央室中加入1%的0.5 ml醋酸鋅，放入濾紙(0.5cm×1.5cm)增加吸收面積。用氮氣將錐形瓶充盈30 s后瓶塞封口，轉移到37℃水浴搖床中開始反應，90 min后向其中注入0.5 ml的50%三氯乙酸中止反應，繼續水浴60 min后向中央室內加入50 μl的N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽(20mmol/L)/HCl(7.2 mol/L)緩沖液及 50 μl FeCl3(30mmol/L)/HCl(1.2 mol/L)緩沖液，充分混勻。20 min后，用全自動酶標儀在波長670 nm測定吸光度，根據H2S標準曲線計算溶液中H2S濃度，組織中3MST活性以單位重量的腦組織在單位時間內生成 H2S的量(nmol·min－1·mg－1pro)表示。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2S對大鼠腦梗死體積的影響 大鼠局灶性腦缺血經TTC染色后，腦梗死區呈白色，非梗死區呈紅色。與假手術組比較，缺血模型組大鼠腦梗死體積明顯增大(P＜0.01)，表明本實驗局灶性腦缺血模型制備成功;與缺血模型組比較，NaHS中、高劑量組大鼠腦梗死體積明顯減小(P＜0.05)，表明外源性給予H2S的供體NaHS可明顯縮小大鼠的腦梗死體積。見表1、圖 1。

2.2 H2S對大鼠腦組織中H2S/3MST的影響 3MST途徑是腦組織生成H2S的重要途徑。本實驗研究結果顯示，與假手術組比較，缺血模型組大鼠腦組織中H2S含量明顯降低，同時3MST活性也明顯降低(P＜0.01)，表明大鼠在發生局灶性腦缺血損傷后，隨著腦缺血體積的增大，腦組織H2S生成減少，同時3MST活性降低，即由3MST途徑生成的H2S明顯減少;與缺血模型組比較，NaHS中、高劑量組大鼠腦組織中H2S含量和3MST活性明顯升高(P ＜0.05或P ＜0.01)，表明外源性給予H2S的供體NaHS可以通過提高3MST的活性從而提升腦組織H2S的含量。見表1。

表1 外源性H2S對大鼠腦缺血體積、腦組織H2S含量和腦組織3MST活性的影響 n=8，

表1 外源性H2S對大鼠腦缺血體積、腦組織H2S含量和腦組織3MST活性的影響 n=8，

注:與假手術組比較，*P ＜0.01;與缺血模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 劑量(mg/kg)腦缺血體積(%)H2S含量(nmol/g)3MST活性(nmol·min －1·mg－1pro)0 36.85 ±3.58 3.15 ±0.39缺血模型組 － 31.38 ±5.04*21.96 ±3.51* 0.98 ±0.21*H-NaHS 2.8 17.50 ±8.46△ 31.73 ±6.25△ 2.64 ±0.51△M-NaHS 1.4 22.75 ±3.88△ 27.15 ±5.97# 2.33 ±0.22△假手術組 －L-NaHS 0.7 30.29 ±1.40 22.67 ±4.94 0.95 ±0.25

圖1 5組腦缺血TTC染色圖

3 討論

線栓法建立大鼠MCAO模型是研究缺血性腦損傷的重要方法，其具有不用開顱，損傷小，易操作且模擬性強等特點，應用較廣泛。本研究建立腦缺血模型時，對傳統經典Longa線栓法［6］制備大鼠MCAO模型進行了改良，即在頸部正中部切口，分離出血管后不用血管夾而代之以縫合線牽引來阻斷頸總動脈的血流，松開牽引即可恢復血流，避免了出現難以控制的出血情況，也不需結扎頸總動脈。結果顯示腦組織切片染色現明顯的梗死區，表明模型制備成功。

腦缺血的病理過程復雜，其發生過程涉及多重的時間和空間級聯反應。其發病機制主要是由于血管硬化或血栓形成等原因引起腦動脈管腔狹窄或栓塞，造成腦局部血流量突然中斷或持續減少，進而引起該動脈供血區腦組織血供不足，導致神經細胞的能量供應突然減少或喪失，繼而引起血管內皮損傷和一系列的神經功能出現障礙。該狀態持續較長時間則引起該腦部缺血區內的神經細胞死亡，即腦梗死。腦缺血發生后，隨著時間的延長，可出現缺血區內的腦組織不可逆性壞死或細胞死亡。而據報道腦卒中患者發病后，若能在3～6 h內得到診治，可得到恢復［7］。因此本研究選擇在大鼠腦缺血后3 h給予NaHS，觀察其對局灶性腦缺血損傷的影響。

本實驗室前期研究結果顯示，局灶性腦缺血發生時CBS活性升高，而給予CBS抑制劑氨基氧乙酸可減輕缺血性腦損傷，提示腦缺血后CBS途徑生成的H2S可加重大鼠局灶性腦缺血損傷［8］，與 Qu 等［9］報道一致。而任彩麗等報道外源性給予相對較低濃度NaHS(25 μmol/kg)可減輕全腦缺血再灌注損傷，其確切機制尚待闡明［10］。本研究參照任彩麗等實驗方法設計高、中、低三種劑量給予NaHS，觀察其對局灶性腦缺血損傷的影響。

80%以上的H2S在體內以NaHS形式存在，只有約20%的H2S以氣體形式存在，NaHS可水解為Na+和 HS－，HS－可與體內的 H+再結合后生成 H2S，H2S和NaHS之間以水解和結合的形式形成一種動態平衡，這樣不但可以保證H2S在體內的穩定，而且可以維持內環境的pH值。H2S在體內主要以單體或結合鹽的形式經腎臟排出體外，其在體內的代謝途徑主要有三條途徑:(1)在線粒體中經氧化代謝;(2)在胞質中經甲基化作用代謝;(3)與血紅蛋白、金屬蛋白、氧化型谷胱甘肽、非硫蛋白等結合后被機體清除。H2S是繼NO和CO之后的第三種氣體信號分子，特別是在中樞神經系統，越來越多的證據表明H2S是一種新型的神經調節因子和信號傳遞分子。目前的研究認為機體催化H2S生成的酶主要為 CBS、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和 3MST。研究已經證實炔丙基甘氨酸(D，L-propargylglycine，PPG)是 CSE的不可逆性抑制劑，氨基氧乙酸(AOAA)為CBS的可逆性抑制劑，而關于3MST的研究尚處于起步階段，其特異性的激動劑和抑制劑有待深入研究。CSE和CBS在體內的分布有明顯的組織特異性，在大鼠體內，CBS主要分布于腦、肝臟、胰腺和腎臟;在小鼠體內，CBS主要分布于腦。在人體內主要分布于大腦和肺臟。CSE主要分布于各種血管組織，腦內未發現CSE的表達。早前的研究認為CBS是腦組織中內源性H2S的惟一來源，而最近Shibuya等［4］發現了腦內合成H2S的另一條重要途徑:即以L-半胱氨酸和α-酮戊二酸為底物，在天門冬氨酸氨基轉移酶的作用下首先生成3-巰基丙酮酸，再在3MST的作用下生成H2S和丙酮酸鹽。他們還發現該途徑生成的H2S占腦組織總H2S的90%，遠超過CBS產生H2S的量。3MST主要分布于神經元、線粒體和血管內皮組織中，而CBS主要分布于星形膠質細胞中，兩者不同的組織分布提示不同途徑產生的H2S可能具有不同的作用。H2S作為一種神經調質，在中樞神經系統中發揮著重要的作用，參與了多種中樞神經系統疾病及缺血性腦損傷的發生發展過程［11－13］。3MST主要存在于神經元線粒體，而線粒體是產生活性氧族的場所，因而推測3MST途徑生成的H2S可能通過抗氧化應激發揮神經元保護作用。然而H2S/3MST是否參與局灶性腦缺血損傷的研究未見報道。本研究結果顯示大鼠局灶性腦缺血損傷發生后腦缺血體積增大，腦組織H2S含量和3MST活性明顯降低，表明H2S/3MST參與了局灶性腦缺血的發生發展過程;給予NaHS治療后，大鼠腦缺血體積明顯減小，腦組織中H2S含量和3MST活性明顯升高，腦缺血損傷得到明顯改善，提示外源性補充H2S可明顯減輕局灶性腦缺血性損傷。其詳細機制有待深入研究。

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4 Shibuya N，Tanaka M，Yoshida M，et al.3-Mercaptopyruvate sulfur transferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain.Antioxid Redox Signal，2009，11:703-714.

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