環境濃度下磺胺混合物對秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)生長、飲食、抗氧化酶及其調控基因表達水平的影響

梁爽，于振洋，尹大強

同濟大學環境科學與工程學院 長江水環境教育部重點實驗室,上海 200092

環境濃度下磺胺混合物對秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)生長、飲食、抗氧化酶及其調控基因表達水平的影響

梁爽，于振洋*，尹大強

同濟大學環境科學與工程學院 長江水環境教育部重點實驗室,上海 200092

磺胺類藥物在環境中的普遍殘留引起了人們對其潛在效應的擔憂。因為磺胺混合物的效應不能通過單個物質效應進行準確預測，所以需要針對混合物效應開展深入研究。將秀麗線蟲暴露于4種常用磺胺藥物(磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑和磺胺甲嘧啶)組成的、環境濃度水平(0.01 mg·L-1)的混合物后，對生長調控基因dbl-1和egl-4，飲食調控基因eat-2和eat-18，過氧化氫酶(CAT)編碼基因ctl-2和ctl-3，壽命調控基因sir-2，以及凋亡調控基因ced-4的表達水平進行檢測。暴露組與空白對照組的結果比較表明，秀麗線蟲dbl-1表達水平沒有顯著變化(下調3%)，egl-4表達下調18%，解釋了生長的抑制效應(抑制率為15.6%)。eat-2和eat-18的表達水平下調幅度相似，介于20%～22%之間，該幅度高于飲食的抑制效應(10.7%)。ctl-2和ctl-3的表達水平上調，分別比空白對照組高101%與66%，該幅度顯著小于0.01 mg·L-1磺胺混合物暴露對CAT活性的刺激效應(比空白對照組高789.5%)。此外，sir-2的表達水平沒有顯著變化，與線蟲壽命沒有受到顯著影響相一致。同時，ced-4表達上調32%，預示凋亡水平的顯著增加。egl-4、eat-2、ctl-2和ced-4基因表達水平的顯著變化分別表明磺胺混合物對β轉化生長因子(TGF-β)，煙酰乙酰膽堿受體(nAChR)、抗氧化系統以及細胞凋亡等多個方面的產生影響。

磺胺混合物；秀麗線蟲；β轉化生長因子；煙酰乙酰膽堿受體；過氧化氫酶；凋亡；環境濃度

磺胺類抗生素普遍用于治療養殖動物，并占據了當今抗生素用量中的較大比例。然而，由于人類對該類藥物的濫用、動物體內的不完全代謝以及污水處理環節中的不完全處理導致這些抗生素在各種環境媒介中普遍殘留[1]。為了評價磺胺抗生素的環境風險，學者們逐步展開該類抗生素對非靶生物的毒性研究。據報道，磺胺抗生素可抑制甲殼蟲的運動和生殖[2-3]，影響線蟲的生長和運動行為[4]，并且能夠影響斑馬魚胚胎的同步運動、心跳以及孵化等生長發育過程[5]。然而，實際環境中的磺胺類污染物多以混合物形態存在[1]，因此單個物質的效應研究并不能夠直接表征這一類藥物的環境效應。

鑒于環境中污染物混合物的普遍存在性，近來對磺胺混合物效應的關注不斷增加[6]。研究表明，磺胺及其前驅物(甲氧芐氨嘧啶)對海洋發光菌會產生急性拮抗抑制效應[7]。含有磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶的混合物對線蟲的死亡會產生協同效應，對倒退運動和體長的抑制效應呈現拮抗效應[8]。這些基于受試生物表觀指標毒性作用的研究表明磺胺抗生素混合物效應不能夠簡單地通過單個物質的毒性進行預測，需要繼續開展混合物效應研究，并需利用分子水平指標(如基因表達水平等)對表觀效應予以闡述。

秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的生長、飲食等多種指標可廣泛用于各種化學物質的毒性研究[9-10]。而且，秀麗線蟲也適合進行基因表達水平的檢測，該指標不僅可以作為新的生物標志物，而且也可以用于闡明毒性機理[11]。在生長調控基因中，egl-4在β轉化生長因子(TGF-β)的上游發揮作用，調控器官功能和細胞體積[12]；同時，dbl-1通過TGF-β的Sma/Mab途徑發揮作用，這是秀麗線蟲身體大小的主要調控途徑[13]eat-2參與到煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)途徑中發揮作用[14]，eat-18與煙堿受體相關[15]，這2種基因通過調控咽喉泵動調節飲食行為。與此同時，環境生物的抗氧化能力，例如過氧化氫酶(CAT)，能夠指示其在環境脅迫存在下的響應與適應能力。秀麗線蟲體內ctl-2編碼的CTL-2蛋白主要在腸上皮細胞的過氧化物酶體中表達[16]，ctl-3編碼的CTL-3主要在咽喉肌肉以及神經細胞體中表達(http://www.wormbase.org)。通過對ctl-2與ctl-3基因表達水平的檢測，還能夠指示該抗氧化響應的潛在位點。此外，一個生物體的壽命和凋亡能夠表征其在多變環境中的適應性和生存能力，線蟲體內的sir-2和ced-4分別參與調控壽命[17]和凋亡[18]。然而，目前尚沒有證據表明上述基因能夠對磺胺混合物有所響應，其中機理需進一步研究。

本研究將秀麗線蟲(C.elegans)暴露于環境濃度水平[1]的4種常用磺胺組成的混合物，然后進行dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4的表達水平，并且進行線蟲生長和飲食的檢測，從而將基因表達水平結果與表觀效應相關聯。本研究的發現能夠為磺胺混合物效應提供基因表達水平的生物標志物，且能為研究磺胺對非靶生物的毒性機制提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 磺胺抗生素

含有磺胺嘧啶(SD,CAS RN: 68-35-9,C10H10N4O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)、磺胺吡啶(SP,144-83-2,C11H11N3O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)、磺胺甲噁唑(SMX,723-46-6,C10H11N3O3S,≥98.0%,Sigma Aldrich,USA)和磺胺甲嘧啶(SMZ,57-68-1,C12H14N4O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)的混合物通過含有體積分數為1%的二甲亞砜(DMSO,Amresco,USA)的鉀溶液(0.051 mol·L-1NaCl與0.032 mol·L-1KCl)[19-20]進行配制。每個磺胺抗生素的濃度都為25.0 mg·L-1，磺胺混合物的總濃度是100.0 mg·L-1。環境水平0.01 mg·L-1濃度[21-22]。

1.2 線蟲培養

在線蟲生長培養基(NGM)上，以尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli OP50)作為秀麗線蟲(C.elegans，N2，野生型)的食物進行培養[23]。采用新鮮配制的次氯酸鈉溶液(質量分數為1% NaClO/0.5 mol·L-1NaOH)殺死成熟線蟲獲得同步化的蟲卵并在20 °C繼續培養36 h從而獲得L3線蟲[24-25]。在線蟲用于暴露前，線蟲在鉀溶液中禁食2 h從而排空內臟中的食物[26]。

1.3 實驗設計

所有暴露實驗在20 ℃具蓋的透明24孔板中進行。每個濃度和空白對照(含1% DMSO的鉀溶液)都有6個孔作為平行實驗組。每個孔含有500 μL磺胺或空白溶液，200 μL鉀溶液(含有500只線蟲)，以及300 μL大腸桿菌OP50菌液。所有暴露溶液中，DMSO的最終濃度都低于0.5%(體積分數)從而減少助溶劑的毒性效應[19,27]。大腸桿菌OP50菌液的獲得途徑如下：將37 ℃、在Lysogeny broth (LB)培養基中培養過夜的大腸桿菌OP50菌液轉移至15 mL離心管中，在4 000 g、20 ℃離心5 min，棄上清液，加入無菌鉀溶液，采用移液器、配合無菌槍頭進行吹打、重懸、稀釋，使1 mL大腸桿菌OP50菌液在570 nm處的吸光度值(OD570)為1.0；然后將大腸桿菌OP50與磺胺或空白溶液中(體積比1:1)平衡24 h后[28]，即可用于線蟲暴露實驗。線蟲暴露72 h后，將每個孔中的線蟲采集到離心管中，經過30 min沉淀后，使用10 mL鉀溶液進行沖洗；再次經過30 min沉淀后，得到的線蟲可用于生長、生化指標以及特定基因表達水平的檢測。

1.4 飲食與生長效應檢測

線蟲飲食和生長在72 h暴露后進行。飲食通過食物的減少進行定量[28-29]。在暴露的開始和結束對每一個孔的OD570進行檢測。含有線蟲的孔中吸光度值的變化(ΔOD)通過不含線蟲孔中的ΔOD進行矯正，以減少大腸桿菌自身的死亡或生長的影響。每一個暴露濃度和空白對照都有6個孔作為重復。線蟲的生長通過線蟲的體長進行表征，體長通過測量顯微拍照所得線蟲圖像中身體中線的折線長度來獲得數據[4]。每個處理組有至少15條線蟲作為重復。

1.5 生化指標檢測

將線蟲采用磷酸鉀緩沖液(PBS，pH 6.0)沖洗、收集到1.5 mL離心管中，均分為2份，一份用于生化指標檢測，一份用于特定基因表達水平的檢測。生化指標的檢測方法如下：(1)將離心管在5 000g、4 ℃條件下離心5 min，棄上清液；(2)使用研磨棒進行冰浴研磨，在用200 μL冰浴中的PBS沖洗研磨棒后，將離心管在5 000 g、4 ℃條件下離心5 min；(3)將上清液分裝3份，其中的2份采用酶聯免疫試劑盒(R&D Systems，Inc.，USA)分別測定總蛋白質含量(TP)與過氧化氫(CAT)含量[28]，剩余1份備用。每個樣品中的CAT含量，表達為相對同一個樣品的TP的百分比，通過該表達形式可消除樣品之間生物量不同引起的差異[28]。每個處理組的樣品檢測3次。

1.6 基因表達定量分析

dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4的表達水平按照改進的Offermann的方法進行檢測[30]，引物序列列于表1中。通過TRIzol劑提取線蟲樣品總RNA，在廠家(M-MLV，Promega)說明書指導下進行cDNA的合成。隨后，總cDNA樣品用于實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，該反應采用SYBR Green Master Mix作為染色劑、利用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System(USA)進行檢測。隨后，目標基因表達采用2-ΔΔCT方法進行定量[31]。計算公式如公式(1)所示，其中CT代表循環次數；x代表目標基因，例如dbl-1等；GPD-2作為內源參照基因；i代表處理組；0代表空白。空白對照組的基因表達歸一為1，基因表達數值大于1時表明基因表達上調，小于1時表明基因表達下調。

2-ΔΔCT=2-((CTx-CTGPD-2)i-(CTx-CTGPD-2)0)

(1)

表1 秀麗線蟲所選基因的引物模板序列Table 1 The template strand sequence for the primer pairs of the chosen genes in Caenorhabditis elegans

1.7 數據處理與統計分析

所有的數據都表達為相對空白對照組中同一指標的百分比(percentage of control,POC)[22]，表達式如公式(2)所示，其中A0代表空白對照組中同一指標的平均數值，A代表暴露組中同一指標的數值。通過該方法，空白對照組中所有指標的POC數值都歸一為100%，POC低于100%表明抑制效應(減少或基因表達的下調，POC高于100%表明刺激效應(基因表達上調)。每一個濃度組中的POC數值都進行正態分布檢測[4]，并采用平均值 ± 標準誤差的形式在圖中進行表達。采用Origin Pro 8.5(Origin Lab Corp.,USA)在濃度組與空白對照組之間進行方差分析(ANOVA)，P < 0.05作為顯著性差異的判斷標準。每次實驗均可得出相似的結果，本文中的圖表源自一次代表性實驗結果。

(2)

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 秀麗線蟲生長基因表達下調與生長抑制相一致

暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物72 h后，秀麗線蟲生長調控基因dbl-1和egl-4表達水平的變化如圖1(Fig.1)所示。dbl-1和egl-4表達水平的POC數值分別為97%和82%。因為該數值低于100%，說明2個基因表達水平下調，與空白對照相比，下調水平分別為3%和18%(P < 0.5)，egl-4受到磺胺混合物的影響高于dbl-1(P < 0.05)。與此同時，磺胺混合物對線蟲生長的效應如圖2(Fig.2)所示。線蟲生長的POC數值小于100%，表現為抑制效應，并且該抑制效應隨著暴露濃度的增加而增強。在0.01 mg·L-1，POC數值為84.4%，相對空白的抑制率為15.6%。生長的抑制效應與egl-4的下調水平更為接近，與dbl-1的下調水平相差較遠。該比較結果進一步說明egl-4在磺胺混合物暴露中受到更大的影響。

egl-4在TGF-β通路的上游發揮作用，dbl-1通過TGF-β中的Sma/Mab通路發揮作用[13]。基因表達水平與生長抑制效應之間的比較結果表明，磺胺混合物產生毒性效應的途徑很可能是通過TGF-β通路，但是并不是通過TGF-β通路中Sma/Mab通路產生效應。同時，egl-4的表達還會影響腸胃、皮下組織以及肌肉的體積，并且影響腸胃和肌肉中的細胞大小[12]。因此，磺胺混合物對線蟲生長的抑制效應可能源自這些器官和細胞尺寸的變化。而且，egl-4能夠編碼一種依賴環鳥苷酸(cGMP)的蛋白激酶，在感覺神經元的TGF-β下游發揮作用，調控秀麗線蟲對攝入食物的響應[32]以及行為過程[33]。秀麗線蟲的EGL-4變異體還表現出嗅覺適應性損傷[34]。因此本研究發現的egl-4表達的下調，還可能擾亂線蟲的飲食以及對環境變化的適應性。因此，egl-4基因表達水平可以作為評價磺胺環境風險的生物標志物。

圖1 磺胺混合物(0.01 mg·L-1)暴露72 h后秀麗線蟲dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4等基因的表達水平

圖2 磺胺混合物暴露72 h后秀麗線蟲生長抑制效應

2.2 秀麗線蟲飲食基因表達下調與飲食減少相一致

秀麗線蟲暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物72 h后，飲食調控基因eat-2和eat-18的表達水平如圖1(Fig.1)所示。eat-2和eat-18的POC數值分別為78%和80%(P < 0.5)。相應地，2種基因表現出的下調水平分別為22%和20%，2種基因表達水平的變化不具有顯著性差異。與此同時，磺胺混合物對線蟲飲食的效應如圖3(Fig.3)所示。線蟲飲食受到磺胺混合物的抑制效應，并且該抑制效應表現出對暴露濃度的依賴性。相對空白組線蟲，暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物的線蟲飲食表現出10.7%的抑制效應。該抑制效應水平明顯低于eat-2和eat-18基因的下調水平，這種差異可能是因為eat-2與eat-18存在基因相互作用[35]。

圖3 磺胺混合物暴露72 h后秀麗線蟲飲食抑制效應

eat-2和eat-18的下調水平相似。值得注意的是，eat-2通過nAChR機制發揮作用[14]，該作用使eat-2表達水平的變化具有指示人類健康影響的作用。nAChR機制在脊椎動物和無脊椎動物的興奮性突觸中發揮重要作用[14]，nAChR功能狀態的變化能夠導致不正常的肌肉萎縮[36]。近期的研究還在致力于根據nAChR機制針對阿茲海默癥、鎮痛和消炎等開展新型治療方法的探索[37]。因此，采用eat-2基因表達水平作為生物標志物，能夠為判斷現有藥物和新型治療對非靶生物的效應提供關鍵信息。

2.3 秀麗線蟲抗氧化基因上調與抗氧化物含量升高相一致

0.01 mg·L-1磺胺混合物對秀麗線蟲過氧化氫酶(CAT)調控基因表達水平的效應如圖1所示。CAT調控基因ctl-2、ctl-3表達水平的POC數值分別為201%、166%(P< 0.05)，即2種基因的表達水平均高于空白對照組，上調水平分別為101%與66%，并且2種基因的上調水平不具有顯著性差異。與此同時，磺胺混合物對線蟲CAT的效應如圖4所示。線蟲的CAT受到磺胺混合物的刺激效應影響，并且該刺激效應隨著暴露濃度的增加而增強。其中，暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物的線蟲CAT表現出高出空白對照789.5%的刺激效應，該刺激效應的水平遠高于ctl-2和ctl-3基因的上調水平。

研究表明，ctl-2編碼的CTL-2蛋白主要在腸上皮細胞的過氧化物酶體中表達[16]，ctl-3編碼的CTL-3主要表達在咽喉肌肉以及神經細胞體中(http://www.wormbase.org)。磺胺混合物對ctl-2和ctl-3基因的調控水平均為上調，而且上調水平相似，該結果表明磺胺混合物誘發秀麗線蟲的抗氧化應激反應位點同時存在于腸胃細胞、咽喉肌肉以及神經細胞中。CAT調控基因的表達上調水平顯著低于CAT表現出的刺激水平，可能由于相應的mRNA存在時間較短所致。因為ctl-2表達水平略高，而且其占據線蟲總CAT活性的絕大部分(約80%)[16]，因此，ctl-2基因表達水平可以作為后續環境效應監測的生物標志物。

2.4 壽命與凋亡相關基因的表達變化

因為壽命對于判斷生物體是否適應環境變化具有重要作用，本研究還檢測了壽命調控基因sir-2[17]的表達水平，結果如圖1所示。sir-2基因表達水平沒有受到磺胺混合物暴露的顯著影響，該結果與磺胺混合物沒有顯著影響線蟲壽命的結果(數據未列出)相一致。本研究的結果表明磺胺混合物沒有對sir-2的表達產生影響，sir-2不適宜用于作為生物標志物。

凋亡是表征生物體對環境變化適應性的另一關鍵指標，因此本研究還檢測了線蟲體內促進凋亡的基因ced-4的表達水平[18]。因為POC數值大于100%，ced-4的表達為上調，該上調比空白高32%(P < 0.5,圖1)。ced-4的顯著上調可能有2個原因。其一，線蟲全部細胞在磺胺混合物暴露中都表現出凋亡程度的增加；其二，線蟲體內某一部分組織器官表現出顯著調亡，例如生殖器官。研究表明，ced-4的mRNA主要在胚胎發生期間表達，大多數細胞程序性死亡都發生在該期間[38]。并且，本研究中線蟲開始暴露時的時間為孵化后36 h，隨后的72 h暴露時間，涵蓋了精子、卵子、受精卵/胚胎形成的全部過程[39]，此生物過程可能為磺胺混合物毒性效應提供了靶目標，從而解釋了ced-4表達的顯著上調，但是該解釋依然需要通過進一步的AO吖啶橙染色予以確認。凋亡基因表達上調導致的細胞死亡(apoptosis,cell loss)增多將促使秀麗線蟲壽命減少[40]，同時抗氧化能力的增加能夠促進壽命延長[41-42]，從而導致了本研究中秀麗線蟲壽命沒有顯著變化的結果，但是該推測也需進一步深入研究。本研究結果不僅說明ced-4表達水平具有良好生物標志物的潛質，而且也為后續毒性機理研究提供了方向。

圖4 磺胺混合物暴露72 h對秀麗線蟲過氧化氫酶(CAT)刺激效應

綜上，暴露于環境濃度水平的磺胺混合物后，秀麗線蟲特定基因的表達水平表現出差異。生長調控基因dbl-1和egl-4表現為下調，而且egl-4下調水平顯著強于dbl-1，并與生長抑制效應表現出更好的相似性。飲食調控基因eat-2和eat-18表現出相似的下調水平，而且這些下調水平顯著高于飲食的抑制效應。過氧化氫酶(CAT)調控基因ctl-2、ctl-3表達上調，但是上調水平顯著低于CAT表現出的刺激水平。同時，凋亡調控基因ced-4的表達顯著上調。研究結果推薦egl-4、eat-2、ctl-2和ced-4的表達水平作為潛在的生物標志物。

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Effects of Sulfonamide Mixtures at Environmental Concentrations on Growth,Feeding,Catalase Activity and the Gene Expression Levels ofCaenorhabditiselegans

Liang Shuang,Yu Zhenyang*,Yin Daqiang

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment,Ministry of Education,College of Environmental Science and Engineering,Tongji University,Shanghai 200092,China

28 March 2015 accepted 17 July 2015

The ubiquitous existence of sulfonamide residues in environments is drawing attentions on their potential effects.Previously,mixture effects of sulfonamides were falsely predicted by simply combining the individual effects.Accordingly,direct investigations on sulfonamide mixture effects are needed.Here,Caenorhabditis elegans was exposed to mixtures containing four commonly used sulfonamides (sulfadiazine,sulfapyridine,sulfamethaxozale and sulfamethazine) at environmental relevant concentration of 0.01 mg·L-1.The expression levels of growth regulating genes (dbl-1 and egl-4),feeding regulating genes (eat-2 and eat-18),catalase (CAT) encoding genes (ctl-2 and ctl-3),lifespan regulating gene (sir-2) and apoptosis regulating gene (ced-4) were analyzed.Compared with the control,dbl-1 expressions in exposure to sulfonamide mixture were not significantly influenced with a slight down-regulation by 3%.Meanwhile,egl-4 expressions were down-regulated by 18%,explaining inhibitions on growth which was 15.6% lower than the control.Both eat-2 and eat-18 expressions were down-regulated by 20%～22%,greater than the inhibition on feeding (10.7% lower than the control).ctl-2 and ctl-3 expressions were up-regulated by 101% and 66% higher than the control,respectively.The up-regulation levels were significantly lower than the CAT stimulations which were 789.5% higher than the control.sir-2 expression was not significantly influenced as well as the lifespan.In addition,ced-4 expression was up-regulated by 32%,indicating increases in apoptosis.The results of egl-4,eat-2,ctl-2 and ced-4 indicated that the involvement of transforming growth factor β (TGF-β) pathway,nicotinic acetylcholine receptor (nAChR),antioxidant responses and apoptosis in the sulfonamide mixture effects,respectively.

sulfonamide mixture; Caenorhabditis elegans; TGF-β; nAChR; CAT; apoptosis; environmental concentration

國家自然科學基金(No.21307095，No.51278353)；中央高校基本科研業務費專項資金(No.2013KJ015)；瑞典研究委員會項目(D0691301)

梁爽(1990-)，女，學士，研究方向為毒理學，E-mail: liang6897@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yuzhenyang3227@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150328010

2015-03-28 錄用日期：2015-07-17

1673-5897(2015)4-088-08

X171.5

A

于振洋(1984—)，男，博士，助理研究員，主要從事污染物毒性效應與機理、化學品生態與健康風險的研究。

梁爽，于振洋，尹大強.環境濃度下磺胺混合物對秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)生長、飲食、抗氧化酶及其調控基因表達水平的影響[J].生態毒理學報，2015,10(4): 88-95

Liang S,Yu Z Y,Yi D Q.Effects of sulfonamide mixtures at environmental concentrations on growth,feeding,catalase activity and the gene expression levels of Caenorhabditis elegans [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 88-95 (in Chinese)