短鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞代謝的影響

耿檸波，張海軍，張保琴，王菲迪，任曉倩，陳吉平,*

1.中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023 2.中國科學院大學，北京 100049

短鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞代謝的影響

耿檸波1,2，張海軍1,#，張保琴1，王菲迪1,2，任曉倩1,2，陳吉平1,*

1.中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023 2.中國科學院大學，北京 100049

短鏈氯化石蠟(short-chain chlorinated paraffins,SCCPs)是一組成分復雜的氯代正構烷烴，在環境中普遍存在。然而有關其毒性機理的信息十分有限，限制了對其健康風險的評估。本研究采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析技術，研究了不同劑量的SCCPs暴露(0、1.0、10.0和100.0 μg·L-1；C13-CPs；55.0% Cl)對人體肝癌細胞HepG2的糖代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝的影響。通過偏最小二乘判別分析(PLS-DA)鑒別各組代謝產物譜差異，發現3個SCCPs暴露劑量組均能夠與對照組完全分開，表明SCCPs短期暴露能夠引起細胞代謝活動的顯著改變。SCCPs的低劑量暴露可明顯刺激HepG2細胞對氨基酸的吸收。與對照組相比，SCCPs低劑量暴露組(1.0 μg·L-1)培養基中谷氨酰胺、色氨酸和絲氨酸的含量顯著(P<0.05)降低。而高劑量SCCPs(100.0 μg·L-1)暴露抑制了細胞對氨基酸和葡萄糖吸收，但促進了乳酸、丙氨酸、半胱氨酸的生成。氨基酸吸收的抑制不可避免地會影響蛋白質的合成。同時，SCCPs的暴露使飽和脂肪酸代謝紊亂，使不飽和脂肪酸水平上調。為確定SCCPs的毒性作用方式，有必要從轉錄組和蛋白組層面進一步研究其毒性機制。

SCCPs；HepG2；代謝物；氨基酸代謝；脂肪酸代謝

SCCPs對器官組織功能、酶活性和內分泌的一系列影響可靈敏地反映在對生物體氨基酸、脂肪酸、糖和其他小分子化合物代謝的影響。近年來。隨著生物體代謝物數據庫的不斷完善，以及小分子代謝物生物學特性研究的不斷發展，從代謝層面對環境污染物的毒性進行研究更具有生物學意義。目前尚沒有涉及SCCPs對生物體代謝影響的研究。本實驗選擇人肝癌細胞HepG2為受試細胞，探討了環境濃度SCCPs暴露對細胞小分子代謝物的干擾作用，通過對糖代謝、氨基酸和脂肪酸代謝干擾的評估，在代謝組層面揭示SCCPs的毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

細胞培養基(DMEM)和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素購自Hyclone 公司(Logan,UT)。MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)購自美國AMRESCO公司，純度>98%；二甲基亞砜(DMSO)和甲醇等其他化學試劑均為國產色譜純試劑。脂肪酸、氨基酸、乳酸、尿素、葡萄糖和甘油等標樣、以及甲基叔丁基醚(MTBE)購自阿拉丁試劑公司。色譜純乙酸銨和甲酸購自百靈威公司。色譜純乙腈和甲醇購自Fisher公司(Fair Lawn,NJ,USA)。所有的實驗用水均為來自Milli-Q系統的超純水(Millipore,Billerica,MA,USA)。所用SCCPs為C13-CP，氯含量為55%，在實驗室通過烷烴氯化反應得到[13]。

1.2 受試生物

HepG2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。細胞培養所用培養基為含有10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM (體積分數)。取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶消化后，將細胞數調整到3×105細胞每孔，種植于6孔培養板中，置于培養箱內(37 ℃,5% CO2)培養。待6孔板鋪滿80%后吸棄原培養基，換上含有SCCPs的培養基培養24 h。SCCPs通過溶于DMSO引入細胞培養液，DMSO在培養基中的最終含量為0.05%(體積分數)，4個劑量組SCCPs含量分別為0、1.0、10.0和100.0 μg·L-1，每組設6個平行樣，對照組只加入體積分數為0.05%的DMSO。

1.3 實驗儀器

Galaxy 48 R型CO2培養箱(美國New Bruns-wick公司)，Tecan多功能酶標儀(Tecan Genesis，瑞士)，Biofuge?Stratos全能臺式高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)，TSQ-QuantumMax高效液相色譜串聯質譜 (HPLC-MS/MS) (美國Thermo公司)。

1.4 實驗方法

當然，我的這種揣測都是短暫的，每每此刻，我都會調整自己，不過是游戲罷了，他在我身上享受到了滿足，我從他那兒得到了擁有金錢的滿足感，何樂不為？何苦還要來思量愛與不愛，愛頂個屁用。

代謝物提取參考Whiley等[14]建立的小分子代謝物提取方法。細胞暴露24 h后，將細胞培養液移至2 mL離心管中，6 000 g × 4 ℃條件下離心10 min，取上清液200 μL凍干，加入400 μL MTBE室溫條件下渦旋提取20 min；然后加入260 μL超純水混勻，10 000 g × 4 ℃條件下離心15 min，取上清350 μL于樣品管中氮氣吹干，用350 μL乙腈復溶，經過0.22 μm濾膜過濾后用于非極性組分的分析。剩余部分用于極性組分的提取，依次加入100 μL MTBE和130 μL甲醇。室溫條件下渦旋20 min，10 000 g × 4 ℃條件下離心15 min，提取體系明顯分層，上層為MTBE相，下層為甲醇-水相。從下層甲醇-水相中取200 μL經過0.22 μm濾膜過濾后，直接用于極性組分的分析。提取前于樣品中加入10 μL混合內標(正亮氨酸，十一酸和十九酸，濃度分別為200，54和34 μmol·L-1，溶劑為乙腈)。

游離脂肪酸組分的分析采用的色譜柱為Ufavour C8柱(150 mm×2.1 mm,3.0 μm)；流動相A為H2O，B為5 mmol·L-1乙酸銨的乙腈，C為乙腈；流動相梯度為(時間，B%，C%，流速)：0～5 min，20% B，70% C，250 μL·min-1；7～15 min，20% B，80% C，250 μL·min-1；16～20 min，20% B，70% C，300 μL·min-1；柱溫箱溫度為40 ℃，進樣量為10 μL。質譜掃描模式為ESI(-)MRM。噴霧電壓為2 500 V；輔助氣為5 psi；鞘氣為30 psi；整個分析過程在20 min內完成。游離氨基酸組分的分析采用Atlantis C18 高效液相色譜柱(waters,150 mm×2.1 mm,3.0 μm)；流動相A為0.5%甲酸的H2O，流動相B為甲醇；流動相梯度為：0～2 min，95%A和5%B；然后在3 min之內A減少為40%，B增加為60%，維持4 min；在1 min內A增加到95%，維持8 min，總流速為200 μL·min-1，進樣量為2 μL。質譜掃描模式為ESI(+)MRM。噴霧電壓為3 000 V；輔助氣為5 psi；鞘氣為30 psi；整個分析過程18 min內完成。

表1 極性組分分析的MS/MS參數Table 1 The MS/MS parameters for polar fraction analysis

表2 非極性組分分析的MS/MS參數Table 2 The MS/MS parameters for apolar fraction analysis

1.5 數據處理

利用Thermo fisher Xcalibur 2.1數據處理軟件進行定量分析，SPSS18統計軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL)用于單因素方差分析(one way ANOVA)，實驗組數據與對照組數據之間的比較采用最小顯著差數法(LSD)，P<0.05被認為是顯著性差異的數據，P<0.01表示差異極顯著。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)基于網絡在線分析系統(http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/Home.jsp)。

2 結果(Results)

2.1 小分子代謝產物的PLS-DA分析

為探討SCCPs暴露是否對HepG2細胞帶來影響。分別對不同劑量暴露組和對照組細胞的小分子代謝產物數據進行了PLS-DA分析，并建立包含第一個主成分(component 1)和第二個主成分(component 2)的二維空間模型，結果如圖1所示。其中表示模型解釋能力的參數R2=0.87，表示模型預測能力的參數Q2=0.65，表明該模型結果可靠，不存在過擬合現象。從圖1可見，3個SCCPs暴露劑量組均能夠與對照組明顯區分開，表明SCCPs短期暴露能夠引起細胞代謝活動的變化，使細胞小分子代謝物發生改變。在3個SCCPs暴露劑量組中，低劑量組(1.0 μg·L-1)和中劑量組(10.0 μg·L-1)在得分圖上有明顯的重合，但均能與高劑量組(100.0 μg·L-1)區分開，表明SCCPs對細胞小分子代謝物的干擾存在一定的劑量依賴性。

圖1 SCCPs暴露組與對照組小分子代謝產物的PLS-DA得分圖

2.2 小分子代謝產物的聚類分析

對22種顯著變化的小分子代謝物進行聚類分析，結果如圖2所示。細胞的代謝物主要表現出3種變化趨勢。與對照組相比，大部分不飽和脂肪酸，以及半胱氨酸，丙氨酸，纈氨酸，乳酸和葡萄糖在SCCPs暴露組中呈現增加趨勢。飽和脂肪酸，如癸酸(10:0)，十二烷酸(12:0)，十六烷酸(16:0)，十八烷酸(18:0)和二十烷酸(20:0)，隨SCCPs暴露劑量的增加表現出非單調變化趨勢；從低劑量組到中劑量組，飽和脂肪酸含量變化趨勢為先降低后升高，當暴露劑量增加到100.0 μg·L-1，其含量出現反彈。第3組包括谷氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，賴氨酸，色氨酸和谷氨酰胺，與對照組相比，這些代謝產物在低中高3個SCCPs暴露劑量組均呈現降低趨勢。

在生物體內每種小分子代謝產物都參與多種代謝通路，受到脅迫后其含量的變化會呈現單調和非單調劑量效應關系，這一現象在代謝組學研究中多有報道[15]。在本研究中，隨著SCCPs暴露劑量的增加，某些氨基酸和脂肪酸含量出現波動并表現出非單調劑量效應關系，暗示細胞在SCCPs的毒性作用下進行了自我調控。這可能是由于SCCPs的多個毒性作用通路共同作用的結果。另外，受到小劑量有害刺激后，細胞會產生預適應，在應激后一段時間內產生保護作用[16]，這也是細胞代謝波動的原因。

2.3 對細胞葡萄糖和氨基酸代謝的影響

圖3顯示了SCCPs暴露24 h后幾個重要差異代謝物的濃度變化情況。其中葡萄糖、谷氨酰胺、色氨酸和絲氨酸為細胞培養基中添加的營養物質；乳酸、丙氨酸、谷氨酸和半胱氨酸為細胞合成物質；葡萄糖、乳酸和丙氨酸是糖酵解的中間代謝產物。與對照組相比，SCCPs高劑量暴露組的葡萄糖水平略有升高，意味著葡萄糖代謝被抑制。細胞中的乳酸絕大部分由葡萄糖通過糖酵解途徑生成，另一方面，細胞中的其他氨基酸可以作為前體物質，間接生成乳酸。乳酸是細胞毒性的重要標志物，在本試驗中，高劑量SCCPs的暴露使乳酸的生成量與對照組相比增加了1倍，增加的乳酸有可能對細胞造成了一定的毒性作用。另外，丙氨酸的水平在高劑量SCCPs暴露下也表現出顯著增加。谷氨酰胺和谷氨酸是參與谷氨酰胺代謝的重要物質，谷氨酰胺通過谷氨酰胺酶生成谷氨酸，并進一步通過谷氨酸脫氫酶或轉氨酶生成α-酮戊二酸進入三羧酸循環，為細胞提供中間代謝物質和能量。與對照組相比，谷氨酰胺水平在SCCPs中低暴露劑量組顯著降低，說明中低劑量水平的SCCPs能夠促進細胞對谷氨酰胺的吸收。但當SCCPs濃度增加到100.0 μg·L-1時，谷氨酰胺水平略有增加，表明高濃度SCCPs抑制了細胞對谷氨酰胺的吸收。隨著SCCPs暴露劑量的增加，谷氨酸水平呈現輕微降低趨勢；相反，半胱氨酸含量顯著增加；而色氨酸和絲氨酸則先降低后增加。

圖2 SCCPs暴露后22種差異代謝物的熱圖和聚類分析結果

圖3 SCCPs暴露對HepG2細胞葡萄糖、乳酸和氨基酸代謝的影響

圖4 SCCPs暴露對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響

2.4 對細胞脂肪酸代謝的影響

如圖4所示，不飽和脂肪酸含量在3個SCCPs暴露組均有上調。與對照組相比，十八碳一烯酸在SCCPs中劑量暴露組有顯著增加，十八碳三烯酸在SCCPs中劑量和高劑量暴露組顯著上調；而十八碳二烯酸和二十碳五烯酸的變化最為顯著，即使在低劑量暴露組亦有顯著增加。在3個暴露劑量組中，飽和脂肪酸的變化趨勢比較一致，呈現先降低，后升高，最后下調的趨勢。與對照組相比，癸酸(10:0)、十二烷酸(12:0)、十六烷酸(16:0)和十八烷酸(18:0)在低劑量暴露組均呈現顯著降低，并且癸酸和十二烷酸在高劑量暴露組也有明顯下降。脂肪酸含量的改變能夠影響細胞生物膜的形成，對細胞的增殖分化產生不利作用。

3 討論(Discussion)

到目前為止，對SCCPs的健康風險評估大多是基于對模式動物的毒理學暴露試驗，體外細胞實驗研究很少。已有研究發現，高濃度SCCPs的長期暴露對大鼠有致癌作用[17]，其對大鼠的無可見有害作用水平(NOAEL)為10 mg·d-1·kg-1[10]，但SCCPs在μg·L-1水平就對水生生物具有慢性毒性效應。Thompson等[18]研究了SCCPs (C10-13,58% C1)對糠蝦(mysid shrimp)和大型蚤(Daphnia magna)的毒性作用，發現96 h的半數效應濃度分別為14和18 μg·L-1。本實驗以HepG2細胞為研究對象，探討了環境濃度水平SCCPs對細胞小分子代謝物的干擾作用。結果表明SCCPs暴露后，HepG2細胞小分子代謝物與對照組相比有明顯的變化，細胞在糖代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝方面發生不同程度的紊亂。

糖代謝和谷氨酰胺代謝是細胞能量的主要供應途徑。葡萄糖和氨基酸消耗的分析結果表明，低劑量SCCPs可刺激細胞對多種氨基酸的吸收，而當暴露劑量增加到100.0 μg·L-1后，SCCPs會抑制細胞對培養基中葡萄糖、谷氨酰胺和多種氨基酸的吸收。葡萄糖通過糖酵解途徑為細胞提供中間代謝物質和能量，同時可生成乳酸。谷氨酰胺可通過三羧酸循環為細胞提供中間代謝物質和能量。高劑量SCCPs暴露后，細胞對葡萄糖和谷氨酰胺消耗減弱，糖酵解和谷氨酰胺代謝可能被抑制，這一變化可能會造成細胞內能量供給不足，從而影響細胞的生長增殖和分化。同時，細胞對氨基酸的吸收和轉化的變化會影響細胞內蛋白質的合成。本研究還發現，盡管糖酵解途徑可能受阻，但乳酸的產生量卻大量增加，此時細胞需要借助其他的途徑產生過量的乳酸。乳酸是細胞毒害作用的重要標志物[19]，增加的乳酸會對肝癌細胞造成一定的毒性作用。這一結果與文獻報道的二噁英對HepG2細胞代謝的干擾是一致的[20]。

脂肪酸類物質在細胞中的平衡對于穩定細胞膜功能、調控基因表達、維持細胞脂蛋白平衡和促進生長分化等方面起著重要作用。SCCPs的暴露使飽和脂肪酸水平紊亂，使不飽和脂肪酸水平上調，引起細胞脂代謝異常。由于動物細胞細胞膜的流動性主要依賴于不飽和脂肪酸的含量，細胞外不飽和脂肪酸含量隨SCCPs暴露劑量的增加而增加；同時高劑量組飽和脂肪酸含量降低，表明SCCPs可能對細胞膜有損傷作用，導致細胞膜流動性降低，這可能是細胞運送營養物質功能降低的主要原因。SCCPs在生物體內與相關代謝降解酶相互作用會導致一定的氧化壓力，脂肪酸代謝紊亂可能是氧化應激和脂質過氧化的結果。Warnasuriya等[21]在研究SCCPs腎毒性作用機制時發現，SCCPs能夠作為一種過氧化物酶體增殖促進劑加速大鼠腎臟的過氧化物酶體增殖；Brunstrom等[22]研究發現，SCCPs能夠影響小雞胚胎中細胞色素P-450酶的含量和微粒體酶的活性；Darnerud[23]對老鼠進行SCCPs暴露后發現，SCCPs能夠被細胞色素P-450酶代謝。細胞脂肪酸代謝的紊亂可能主要受PPAR信號通路的調控。Elcombe等[24]研究發現，SCCPs暴露后引起大鼠肝臟過氧化物酶體增殖，由于過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)能夠調控肝細胞脂肪酸代謝相關基因的表達，本研究中細胞脂肪酸代謝的紊亂可能受PPAR信號通路的調控。在今后的研究中，應該從轉錄組和蛋白組層面追蹤SCCPs干擾PPAR信號通路的分子機制。

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Effects of SCCPs Exposure on the Metabolism in HepG2 Cells

Geng Ningbo1,2,Zhang Haijun1,#,Zhang Baoqin1,Wang Feidi1,2,Ren Xiaoqian1,2,Chen Jiping1,*

1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China 2.Graduate School of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China

7 March 2015 accepted 21 May 2015

Short chain chlorinated paraffins (SCCPs,C10-13) are a large and complex group of polychlorinated n-alkanes,and ubiquitously found in the environment.However,very limited information is available for their toxicity mechanism,limiting the evaluation of their health risks.In this study,liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was adopted to investigate the influence of SCCPs exposure with different doses (0,1.0,10.0 and 100.0 μg·L-1; C13-CPs; 55.0% Cl) on the metabolism of glucose,amino acids and fatty acids in human hepatoma HepG2 cells.The result of partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) showed that all SCCPs exposure groups were clearly distinct from the control group,indicating a significant metabolic perturbation induced by SCCPs.Low-dose SCCPs exposure promoted the import of extracellular amino acids into cells.Compared with the control group,the contents of glutamine,tryptophan and serine in the culture medium of low-dose SCCPs exposure group (1.0 μg·L-1) were significantly decreased (P<0.05).However,the high-dose SCCPs exposure (100.0 μg·L-1) inhibited the transport of amino acids and glucose into cells,and significantly up-regulated the biosynthesis of lactic acid,alanine and cysteine.The disorder of amino acids metabolism would inevitably affect the protein biosynthesis.Meanwhile,SCCPs perturbed the metabolism of unsaturated fatty acids,and markedly up-regulated the contents of polyunsaturated fatty acids.In order to make sure the mode of action of SCCPs,transcriptomic and proteomic evidences on SCCPs toxicity should be further provided.

SCCPs; HepG2; metabolites; amino acid metabolism; fatty acid metabolism

國家“863”項目 (2013AA065203)；國家自然科學基金(21337002,21277141)

耿檸波(1985-)，女，博士研究生，研究方向為環境毒理學，E-mail: gengningbo@dicp.ac.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: chenjp@dicp.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150307005

2015-03-07 錄用日期：2015-05-21

1673-5897(2015)4-115-08

X171.5

A

陳吉平(1964)，男，分析化學博士，研究員，主要從事分析化學與環境化學及其相關的基礎與應用研究，發表學術論文90余篇。

#共同通訊作者(Co-corresponding author),E-mail: hjzhang@dicp.ac.cn

耿檸波，張海軍，張保琴,等.短鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞代謝的影響[J].生態毒理學報，2015,10(4): 115-122

Geng N B,Zhang H J,Zhang B Q,et al.Effects of SCCPs exposure on the metabolism in HepG2 cells [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 115-122 (in Chinese)