冠狀動脈疾病患者CD36基因多態性與心血管相關因素的關系

趙寧，張慧杰，王建昌

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論著·臨床

冠狀動脈疾病患者CD36基因多態性與心血管相關因素的關系

趙寧，張慧杰，王建昌

目的 研究CD36基因多態性與冠狀動脈疾病(CAD)危險因素之間的關系。方法 選擇解放軍空軍總醫院<60歲90例CAD患者，抽取患者空腹靜脈血檢測血紅蛋白(Hb)、白細胞(WBC)、單核細胞(M)、嗜堿性粒細胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同時記錄患者的體質量、收縮壓、舒張壓，并計算體質量指數和平均動脈壓。利用變性高效液相色譜技術(DHPLC)分析包含內含子片段的外顯子4和5的擴增產物，分析基因型和各變量之間的相關性。結果 發現CD36 基因有兩種多態性變異：IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A(rs3211892)。其中IVS3-6 T/C多態性的C等位基因與肥胖、糖尿病、血清Lp(α)濃度降低以及心肌梗死發病年齡提前有關。而IVS4-10 G/A多態性的A等位基因與心肌梗死發病較晚和白細胞數量增加有關。結論 CD36的IVS3-6 C等位基因與心血管疾病的危險因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有關，與心肌梗死發病年齡提前有關；而IVS4-10 A等位基因與心肌梗死發病年齡推遲有關。CD36 的多態性在CAD中的作用仍需進一步研究。

基因多肽性CD36；冠心病；心肌梗死

隨著生活水平的提高，冠心病的發病年齡已經有低齡化的趨勢。近年來遺傳因素在冠心病發病機制中的地位越來越引起人們的重視。CD36是一種位于多種細胞(血小板、內皮細胞、巨噬細胞、樹突細胞、脂肪細胞、橫紋肌細胞、造血干細胞等)表面的B型清除受體。其介導的主要功能涉及到脂質利用、胰島素抵抗、炎性反應、動脈粥樣硬化和血栓的形成，在動脈粥樣硬化中起重要作用，在白種人中的研究發現CD36 基因多態性與心血管疾病的風險具有明顯的相關性，特別是游離于循環系統的單核細胞CD36 mRNA的表達可能是發生冠狀動脈疾病高風險的一個標志，但目前還沒有直接證據證明CD36基因突變能降低或增加高血脂、動脈硬化及其并發癥(血管功能障礙、高血壓、缺血性心臟病)的風險[1～3]，而且CD36基因是否在漢族人群中存在多態性目前還沒有報道，為了解決這些問題，我們觀察了其基因多態性中CD36 基因編碼氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和脂酸結合結構域區域的序列變化與冠狀動脈疾病(CAD)已知的危險因素之間的關系，為冠心病的早期診斷、危險人群的篩選和基因治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年1月—2010年12月在我院就診的60歲以下CAD患者90例。納入標準：臨床狀況穩定，無急性冠狀動脈癥狀，在近期(1年內)沒有進行血管再通術治療。排除標準：有先天性血液動力學紊亂或獲得性心臟瓣膜病，有癥狀心力衰竭 (NYHA>1級), 腎衰竭(肌酐>265 μmol/L),1型糖尿病, 甲狀腺功能不全, 惡性腫瘤。CAD診斷主要通過冠狀動脈血管造影，符合下列特征之一即可確定診斷：(1)左冠狀動脈狹窄程度≥40%；(2)心外膜下3個主要側支之一狹窄程度≥50%；(3)動脈分支狹窄程度≥70%。該試驗完全遵循赫爾辛基宣言并獲得我院倫理審查委員會的批準，試驗前所有患者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標和方法 抽取患者空腹靜脈血檢測血紅蛋白(Hb)、白細胞(WBC)、單核細胞(M)、嗜堿性粒細胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同時記錄患者的體質量、收縮壓、舒張壓，并計算體質量指數和平均動脈壓。

1.3 基因檢測 空腹狀態下取肘部靜脈血3 ml促凝離心后取上清液，-80℃保存。分離血細胞目標基因組DNA[4]，具體步驟參考AxyPrep血液全基因組DNA小量提取試劑盒說明書；使用變性高效液相色譜(DHPLC)技術研究包含內含子片段的外顯子4和5的擴增產物[5]。通過DHPLC 檢測PCR產物的變化，并使用Applied Biosystems公司的染料終止子循環測序反應試劑盒對其進行雙向測序。使用373A DNA片段分析儀進行半自動序列分析(Applied Biosystems, Foster City, CA)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，根據CD36 基因型將病例分組，計量資料使用Mann-Whitney U 檢驗和t檢驗，使用精確檢驗評估Hardy-Weinberg平衡下的基因型分布的一致性。計算比值比 (OR)及其95%可信區間(95%CI)，分析基因型和定性變量之間是否有顯著的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD36基因多態性 DHPLC檢測到的變異主要包括內含子中2個單核苷酸替換(多態性),即IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892)，外顯子中并未發現序列改變。2種序列變異在Hardy-Weinberg平衡下基因型分布一致(P=1)。說明實驗選取的樣本基因型可以穩定遺傳，可以代表整個群體。見表1。

表1 患者CD36基因多態性

2.2 不同CD36 基因型患者的臨床參數比較 IVS3-6 TC雜合子患者較TT純合子患者體質量指數稍高，肥胖明顯(BMI≥30 kg/m2) (OR=2.93,95%CI 0.98～8.76,P=0.07)。糖尿病發病率高(OR=6.09,95%CI 1.66～22.32,P=0.01),既往心肌梗死患者中，TC基因型患者的心肌梗死發病年齡提前(OR=1.346，95%CI 0.528～3.429，P=0.057)。相反，IVS4-10 GA雜合子患者比野生型GG純合子心肌梗死首次發病年齡要晚(OR=3.453，95%CI1.532～7.786，P=0.003)。見表2。

2.3 不同CD36基因型患者的血細胞數和生化數據比較 IVS3-6 TC 雜合子白細胞中嗜堿性粒細胞的比例比TT患者低(OR=5.21,95%CI 2.464～11.3，P=0.03)。IVS3-6 TC基因型hs-CRP較TT基因型高(OR=2.93,95%CI 1.8～9.6,P=0.02)，Lp(a)低(OR=5.039，95%CI 2.173～11.883，P=0.01)。IVS4-10 GA基因型白細胞數更高(OR=2.17, 95%CI 1.05～4.57，P=0.03)。見表3。

3 討 論

隨著人們生活水平提高、人口老齡化加重及城市化發展進程加快，冠心病及其相關并發癥的發病率在逐年提高，已經成為影響健康的首要疾病。近年來，對于冠心病發生相關基因水平的研究已越來越受到人們的重視[6]，并發現了大量與心血管疾病發生相關的單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphism,SNP)，這些方法為冠心病診斷提供方便可行的分子標記，以早期預測高風險人群并指導預防和治療[7～9]。在本研究中，我們發現中國人CD36內含子片段中有IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892)2種多態性[10]，2種變異均與心臟疾病的發生有關。IVS3-6 TC 和IVS4-10 GA基因型與心肌梗死發病年齡之間也存在相關趨勢(P=0.057)或顯著相關性(P=0.003)，但相關性相反：TC雜合子首次發病的年齡更小，而GA雜合子首次發病年齡更大。此外IVS3-6 TC雜合子與3種心血管危險因素有關，分別為hs-CRP、肥胖發病率、糖尿病史[11]，其中IVS3-6 TC 雜合子比野生型純合子患者更易患2型糖尿病，但各組間空腹血糖并無差異，分析原因可能是由于多數TC雜合子的糖尿病患者口服降糖藥或使用胰島素所致。而IVS4-10 GA雜合子患者中2型糖尿病的發病率與野生型沒有差別。在國外同類研究中Leprêtre等[11]指出白種人CD36的IVS4-10 G/A變異與脂類代謝水平之間有相關性，Love-Gregory等[12]研究了有高血壓的非裔美國人中發現的所有的CD36 序列變異(內含子3中的rs3211850；內含子9中的rs3173804；外顯子10中的無義突變rs3211938；3′ UTR中的rs7755, rs13246513和rs13230419)均與體格參數(BMI>30 kg/m2，腰圍>100 cm)相關，白種人rs1527479 CD36 啟動子多態性與胰島素抗性和2型糖尿病有關。這些研究和我們的結論基本是一致的。最新的研究還提出在非裔美國人中CD36 多態性可能會導致血漿HDL-C濃度增加[13]，在有文獻報道成人雙生子登記隊列中CD36啟動子多態性rs2151916與LDL-C水平有關：次要等位基因純合子患者 LDL-C水平更低[14]。內含子11中的1種多態性(rs1527483)和3′UTR 區(外顯子14和15)的2種多態性(rs3840546, rs1049673)與血漿游離脂肪酸代謝有關。但在我們的試驗觀察到2種基因型間血脂濃度沒有顯著差異，這主要是因為我們試驗中幾乎所有病例均服用了他汀類藥物，影響試驗結果[15]。但另一方面我們還發現IVS3-6 TC基因型與Lp(a)降低有關, 這可能是動脈粥樣硬化疾病(如冠心病和中風)的危險因素。非洲人的外顯子10純和無義突變(rs3211938)與血紅蛋白水平提高有關。在我們的試驗中并未發現不同組間血紅蛋白水平存在差異，卻發現IVS4-10 GA 雜合子患者的白細胞數量更多。目前尚沒有這種相關性報道的出現，其臨床意義還有待進一步研究。

表2 不同CD36 基因型患者的臨床資料比較

表3 不同CD36基因型的生化指標比較

總之，CD36的IVS3-6C等位基因的多態性與心血管疾病的危險因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有關。IVS3-6 C等位基因與心肌梗死發病年齡提前有關，而IVS4-10 A等位基因與心肌梗死發病年齡推遲有關。基因的這種突變對冠狀動脈疾病的風險以及臨床病程的功能性意義，還需要進一步的評估。

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7 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

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11 Leprêtre F,Linton KJ,Lacquemant C,et al.Genetic study of the CD36 gene in a French diabetic population[J].Diabetes Metab,2008,30(3):459-463.

12 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

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14 Silverstein RL.Inflammation, atherosclerosis, and arterial thrombosis: role of the scavenger receptor CD36[J].Cleve Clin J Med,2009,76(Suppl 2):S27-S30.

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撰寫醫學論文主體部分的要求

1 前言 概述研究的背景、目的、研究思路、理論依據、研究方法、預期結果和意義等。僅需提供與研究主題緊密相關的參考文獻，切忌寫成文獻綜述。不要涉及本研究中的數據或結論。一般以200～300個漢字為宜，占全文字數的5%左右。

2 方法 描述研究對象(人或實驗動物，包括對照組)的選擇及其基本情況，以及研究所采用的方法(包括分組方法)。實驗研究的論文常寫成“材料與方法”，臨床研究論文常寫成“資料與方法”。臨床試驗研究還應說明試驗程序是否經所在單位或地區倫理學相關機構的批準，研究對象是否知情同意并簽署知情同意書。

2.1 觀察對象： 觀察對象為患者，需注明病例和對照者來源、選擇標準、一般情況、觀察指標和療效判斷標準等。研究對象為實驗動物，需注明動物的名稱、種系、等級、數量、來源、性別、年齡、體重、飼養條件和健康狀況等。

2.2 研究方法： 詳述新創的方法及改良方法的改進之處，以備他人重復。采用他人方法，應以引用文獻的方式給出方法的出處，無須詳細描述。

2.3 藥品與試劑： 藥品及化學試劑使用通用名稱，并注明劑量、單位、純度、批號、生產單位、生產時間及給藥途徑。

2.4 儀器、設備： 應注明名稱、型號、規格、生產單位、精密度或誤差范圍。無須描述工作原理。

2.5 統計學處理： 描述統計學方法及其選擇依據, 并說明所使用的統計學軟件。

3 結果 “結果”是指實驗所得數據、觀察記錄，經過綜合分析和統計學處理的結果，而不是原始數據，更不是原始記錄。按邏輯順序在正文的文字、表格和圖中描述所獲得的結果。結果的敘述應實事求是，簡潔明了，數據準確，層次清楚，邏輯嚴謹，不應與討論內容相混淆。應著重總結重要的研究結果。以數據反映結果時，應注意不能只描述導數(如百分數)，還應同時給出據以計算導數的絕對數。一般應對所得數據進行統計學處理，并給出具體的統計值，例如：t= 2.85，P<0.01。

4 討論 “討論”是對研究結果的科學解釋與評價，是研究所形成的科學理論。著重討論研究結果的創新之處及從中導出的結論，包括理論意義、實際應用價值、局限性，及其對進一步研究的啟示。如果不能導出結論，也可通過討論，提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。應將本研究結果與其他有關的研究相比較，并將本研究結論與目的聯系起來討論，并列出相關參考文獻。不必重述已在前言和結果部分詳述過的數據或資料。不應列入圖或表。

Polymorphism of CD36 gene and cardiovascular risk factors in patients with coronary artery disease

ZHAONing,ZHANGHuijie，WANGJianchang.DepartmentofInternalMedicine,AirForceGeneralHospital,PLA,Beijing100142,China

Correspondingauthor:WANGJianchang,E-mail：1084292231@qq.com

Objective To investigate the relationship between CD36 gene polymorphism and coronary artery disease (CAD)’s risk factors.Methods 90 CAD patients aged <60 were collected, hemoglobin (Hb), white blood cell (WBC), mononuclear cells (M), basophils (B),fasting blood glucose (FPG), high sensitive C reactive protein (hs-CRP), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglyceride(TG),apolipoprotein A1(ApoA1), ApoB and lipoprotein (α) [Lp (α)]were detected. At the same time recording quality, systolic pressure, diastolic pressure volume of patients, and calculated the body mass index and mean arterial pressure. Using denaturing high performance liquid chromatography to analyze intron fragment containing exon 4 and exon 5’s amplicon, analyzed the correlation between the genotype and the variables.Results There are two kinds of polymorphism of CD36 gene: IVS3-6 T/C (rs3173798) and IVS4-10 G/A (rs3211892).The IVS3-6 T/C polymorphism of C alleles was correlated with obesity, diabetes, serum Lp (a) concentration decreases and the early age onset of myocardial infarction. While the number of IVS4-10 G/A polymorphism of A alleles was related to late myocardial infarction and increase of white blood cell.Conclusion CD36’s IVS3-6 C allele was correlated with the risk factors of cardiovascular disease (such as hs-CRP, BMI and type 2 diabetes mellitus), and correlated with early age onset of myocardial infarction; while the IVS4-10 A allele was correlated with late age onset of myocardial infarction. The role of CD36 polymorphism in CAD is still needs further research.

Gene polymorphyism，CD36;Coronary heart disease; Myocardial infarction

100142 北京，解放軍空軍總醫院心臟中心

王建昌，E-mail：1084292231@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.05.004

2014-07-09)