氯胺酮聯合氟西汀對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達的影響

沈一維,律 峰,黎 平,羅 潔,謝 飛,閔 蘇

(重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科, 重慶 400016)

氯胺酮聯合氟西汀對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達的影響

沈一維,律 峰,黎 平,羅 潔,謝 飛,閔 蘇

(重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科, 重慶 400016)

目的 探討氯胺酮聯合氟西汀對抑郁大鼠行為學以及對大鼠腦內前額葉神經型一氧化氮合酶(nNOS)羧基末端PDZ配體(CAPON)的影響。 方法 健康成年♂ SPF級SD大鼠，體質量220～270 g，2.5～3月齡，采用慢性輕度不可預見性應激法建立抑郁模型。選建模成功的大鼠96只，采用隨機數字表法，將其隨機分為4組(n=24)：抑郁對照組(D組)、氯胺酮組(K組)、氟西汀組(F組)及氯胺酮聯合氟西汀組(KF組)。再根據給予藥物處理時間的不同，各組隨機分為2個亞組(n=12)：處理3 d組(D3、K3、F3、KF3)和處理7 d組(D7、K7、F7、KF7)。D組行空白對照處理，K組給予氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射；F組給予氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃；KF組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃。根據所在亞組分別給予各組連續3 d或7 d處理，每天1次。于建模前1 d，建模后1 d及藥物處理結束后1 d采用曠場實驗和糖水偏好實驗評價其抑郁狀態。所有行為學檢測完成后1 d處死大鼠，分別采用免疫組織化學法和RT-PCR法檢測前額葉nNOS、CAPON蛋白及其mRNA的表達。結果 與建模前比較，各組大鼠建模后水平運動距離、直立次數減少，糖水偏好比下降(P<0.05)，且各組間差異無統計學意義(P>0.05)。在藥物處理3 d后，與D3組比較，K3組和KF3組水平運動距離、直立次數增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達下調，CAPON蛋白及其mRNA表達上調(P<0.05)。在藥物處理7 d后，與D7組比較，K7組,F7組和KF7組水平運動距離、直立次數增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達下調，CAPON蛋白及其mRNA表達上調(P<0.05)；與F7組比較，KF7組水平運動距離、直立次數增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達下調，CAPON蛋白及其mRNA表達上調(P<0.05)。結論 氯胺酮聯合氟西汀較單獨使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強，且抗抑郁起效時間縮短，其機制可能與氯胺酮聯合氟西汀可降低大鼠腦內前額葉nNOS表達及升高其配體CAPON的表達有關。

氯胺酮；氟西汀；抑郁；前額葉；神經型一氧化氮合酶；神經型一氧化氮合酶羧基末端PDZ配體

抑郁癥是一種高患病率、高致殘率及高自殺率的慢性精神障礙性疾病。據世界衛生組織統計，抑郁癥已成為世界第四大疾患，預計到2020年，可能成為僅次于冠心病的第二大疾病[1]。抑郁癥的發病機制至今仍未完全清楚，而傳統的抗抑郁藥物起效慢且緩解率低[2]，大樣本臨床研究統計發現，要表現出顯著有效的治療效果常需數周乃至數月，且通常僅1/3的病人對單次給藥有效[3]，臨床迫切需要一種起效更迅速，緩解率更高的治療方案。

近年來，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑氯胺酮被發現具有快速抗抑郁作用[4]，但機制仍不明確。其傳統的抗NMDA效應并不能完全地解釋相關機制。而選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑氟西汀是臨床最常用的抗抑郁藥物。神經型一氧化氮合酶(nNOS)通過催化產生一氧化氮(NO)在抑郁癥的發生發展中起著重要作用[5]，nNOS的活性與其羧基末端PDZ配體(CAPON)密切相關，CAPON可減少NMDA受體介導的Ca2+內流，限制NO的產生，參與了nNOS引起的病理生理改變[6]。故本研究擬通過觀測氯胺酮聯合氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用，探討其對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達的影響。

1 材料

1.1 動物SPF級成年♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，購自重慶醫科大學實驗動物中心，批號SYXK(渝)2010-0002。

1.2 主要材料與試劑氯胺酮(批號101221，福建古田制藥廠)；氟西汀(批號：7052069，禮來蘇州制藥)；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP-9001，美國ZYMED公司)；DAB顯色劑(ZLI-9018，北京中杉金橋)；抗nNOS抗體(美國Cell Si gnaling Technology公司)；抗CAPON抗體(美國Santa Cruz公司)；TRIzol試劑盒(北京鼎國生物技術有限公司)。

1.3 主要儀器曠場行為追蹤系統(ZH-ZFT型，淮北正華生物儀器設備有限公司)；顯微鏡(BX51型，日本Olympus公司)；圖像分析系統(Image Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics公司)。

2 方法

2.1 倫理學本實驗獲得了重慶醫科大學動物實驗倫理委員會的批準。

2.2 實驗分組及處理健康成年♂SPF級SD大鼠，體質量220～270 g，2.5～3月齡。實驗前全部動物均進行1周適應性飼養，自由攝食、飲水，并保持飼養室內安靜，溫度22℃左右，濕度55%～65%和12 h/12 h明暗交替。參照文獻[7]制備慢性輕度不可預見性應激(CUMS)模型。每天隨機給予一種刺激(連續束縛2 h；明暗顛倒24 h；鼠籠傾斜24 h；潮濕墊料24 h；禁飲24 h；禁食24 h；4 ℃冰水游泳5 min；45熱應激5 min；每分鐘搖晃1次，持續15 min；夾尾1 min)，同種刺激不連續出現，持續28 d。建模后經行為學測試(曠場實驗及糖水偏好實驗)評估，較建模前下降30%以上的大鼠選為抑郁大鼠模型。

取抑郁模型建立成功的大鼠96只，采用隨機數字表法，將其隨機分為4組(n=24)：抑郁對照組(D組)、氯胺酮組(K組)、氟西汀組(F組)及氯胺酮聯合氟西汀組(KF組)。再根據給予藥物處理時間的不同，各組隨機分為2亞組(n=12)：處理3 d組(D3、K3、F3、KF3)和處理7 d組(D7、K7、F7、KF7)。K組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予生理鹽水10 ml·kg-1灌胃；F組生理鹽水10 ml·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1配制生理鹽水混懸液10 ml·kg-1灌胃后；KF組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1配制生理鹽水混懸液10 ml·kg-1灌胃；D組生理鹽水10 ml·kg-1腹腔注射，即刻給予生理鹽水10 ml·kg-1灌胃。各組每天處理1次，根據所在亞組組別連續3 d或7 d。

2.3 行為學測試采用曠場測試和糖水偏好實驗評價其抑郁狀態。 分別于建模前1 d，建模后1 d及處理結束后1 d，參照文獻[8]的方法進行曠場測試和糖水偏好實驗。選擇上午9 ∶00～12 ∶00于安靜的房間內進行觀察。曠場測試：使用曠場行為追蹤系統進行測試，將大鼠放于曠場箱中央，計算3 min內大鼠水平運動距離及直立次數。每只大鼠測試完畢均徹底清潔，用酒精擦拭曠場箱后再進行下一只的測試。糖水偏好實驗前先訓練大鼠適應糖水(24 h內同時給予兩瓶1%蔗糖水，500 ml/瓶)，測試前禁食禁水23 h，隨后每籠放入純水和1%蔗糖水各1瓶(500 ml/瓶)，1 h后分別測量糖水和純水的消耗量，計算糖水偏好比(糖水偏好比/%=糖水消耗量÷總液體消耗量×100%)。

2.4 免疫組織化學檢測nNOS蛋白及其配體CAPON蛋白的表達于所有行為學檢測完成后1 d，各組隨機選擇6只大鼠，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，以4%多聚甲醛經升主動脈灌注內固定，斷頭取腦，切取大鼠前額葉腦組織。常規石蠟包埋、切片、片厚5 μm。nNOS蛋白的檢測：使用SP-9001過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒進行免疫組織化學檢測。常規二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，熱抗原修復20 min，3%H2O2去離子水室溫孵育15 min，山羊封閉血清，室溫孵育30 min后滴加一抗nNOS(1 ∶50)，4℃冰箱中保存過夜，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育30 min，加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，以DAB顯色(除滴加山羊血清封閉液外，每步反應前均用PBS沖洗3次×5 min)。陰性對照組用PBS液代替一抗孵育，其余步驟相同。顯色后烘干，二甲苯透明后封片。CAPON蛋白的檢測方法同nNOS蛋白，不同點在于一抗選用CAPON(1 ∶100)，每步反應前的沖洗使用TBS代替PBS。每組大鼠隨機選擇5張切片，每張選取5個視野，顯微鏡下觀察，以Image Pro Plus 6.0圖像分析系統分析前額葉陽性表達區的光密度值，以反映nNOS蛋白及其配體CAPON蛋白表達。

2.5 RT-PCR檢測nNOS mRNA及其配體CAPON mRNA的表達各組剩余的6只大鼠，麻醉下快速斷頭，在去焦碳酸二乙醋水成的冰面上利用滅酶器械迅速分離前額葉，液氮凍存。總RNA按TRIzol試劑盒說明書的步驟提取。每組取4 μg總RNA采用二步法進行反應。第1步為cDNA的合成，參照逆轉錄酶M-Mulv Reverse Transciptase使用說明書的步驟進行，第2步為PCR擴增。參照GenBank 公布的nNOS、CAPON及內參β-actin序列，設計nNOS上游引物為5′-TGAAAGCACCAGCACCTACCAG-3′，下游引物5′-GGCACAATCCACACCCAGTC-3′ (擴增產物879 bp)；CAPON上游引物為5′-GATGCCTGACTCTCGGAACTT-3′，下游引物5′-CAGCCGAGGATAACCAGCCGAT-3′(擴增產物144 bp)；內參β-actin上游引物為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(擴增產物540 bp)。擴增條件：95℃預變性2 min，95℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸1 min,30個循環后，72℃補充延伸5 min。取4 μl產物在1.5%瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，紫外燈下觀察結果，拍照并保存。通過Quantity One圖像分析軟件對電泳條帶進行半定量分析，nNOS mRNA 及其配體CAPON mRNA分別和β-actin mRNA的光密度比值代表其各自的相對表達水平，重復3次，取平均值作為結果。

3 結果

3.1 各組大鼠曠場試驗結果與建模前比較，建模后大鼠水平運動距離及直立次數減少(P<0.05)。各組大鼠建模后水平運動距離和直立次數的差異無統計學意義(P>0.05)。在給予藥物干預3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組水平運動距離及直立次數增多(P<0.05)。在給予藥物干預7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組水平運動距離及直立次數增多(P<0.05)；與F7組比較，KF7組水平運動距離及直立次數增多(P<0.05)。見Tab 1、2。

Tab 1 Comparison of distance and rearing number before andafter model in CUMS depressed ±s，n=96)

*P<0.05vspre-model

GroupPost-modelDistance/cmRearingnumberPost-treatmentDistance/cmRearingnumberD3291±734.3±1.9297±1084.1±2.2K3286±1033.5±1.1476±92#7.6±3.1#F3301±993.9±1.4304±774.0±1.3KF3276±844.1±0.9491±103#7.9±2.3#D7311±893.8±1.1317±913.9±1.9K7277±934.0±2.1504±107*9.1±2.4*F7294±773.7±1.3476±92*8.2±1.7*KF7303±943.2±1.8607±96*△11.3±3.3*△

#P<0.05vsgroup D3；*P<0.05vsgroup D7；△P<0.05vsgroup F7

3.2 各組大鼠糖水消耗實驗的結果與建模前比較，建模后大鼠糖水偏好比降低(P<0.05)。各組建模前糖水偏好比的差異無統計學意義(P>0.05)。在給予藥物干預3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組糖水偏好比升高(P<0.05)。在給予藥物干預7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組糖水偏好比升高(P<0.05)；與F7組比較，KF7組糖水偏好比升高(P<0.05)。見Tab 3、4。

Pre-modelPost-modelSPP83.9±2.253.4±1.7*

*P<0.05vspre-model

GroupPost-modelPost-treatmentD354.5±2.757.3±2.9K352.7±2.670.9±2.3#F353.9±1.859.2±2.4KF351.3±2.169.9±1.8#D753.9±1.956.4±1.9K749.5±1.173.6±2.2*F748.8±2.469.3±2.9*KF751.7±3.179.6±2.0*△

#P<0.05vsgroup D3;*P<0.05vsgroup D7;△P<0.05vsgroup F7

3.3 各組大鼠前額葉nNOS蛋白、CAPON蛋白及其mRNA表達的比較在給予藥物干預3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組CAPON 蛋白及其mRNA表達增加，nNOS蛋白及其mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。在給予藥物干預7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組CAPON蛋白及其 mRNA表達增加，nNOS蛋白及其mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與F7組比較，KF7組CAPON蛋白及其mRNA表達增加，nNOS 蛋白及其mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見Tab 5，Fig 1、2、3。

Fig 1 Expressions of nNOS and CAPON mRNA in prefrontal lobe of rats in each group (RT-PCR)

Fig 2 Expression of nNOS in prefrontal lobe of rats (SP×400). The nNOS protein is mainly expressed in cytoplasm, marrow position is target protein. The nucleus for hematoxylin staining appear blue.

Fig 3 Expression of CAPON in prefrontal lobe of rats (SP×400). The CAPON protein is mainly expressed in cytoplasm, marrow position is target protein. The nucleus for hematoxylin staining appear blue.

Tab 5 Expressions of nNOS, CAPON protein and mRNA inprefrontal lobe of rats in each ±s,n=6)

#P<0.05vsgroup D3;*P<0.05vsgroup D7;△P<0.05vsgroup F7

4 討論

CUMS是目前抑郁癥機制研究中應用最廣泛的抑郁模型，能夠有效的模擬人類環境應激所導致的抑郁癥狀[7,9]，并已成功應用于本課題組前期研究中[10-11]。本研究發現CUMS方法建模后抑郁大鼠的行為學指標均低于建模前，表明建模后大鼠快感缺失，對新環境探索能力和興奮程度下降，這與臨床上抑郁癥狀精神運動抑制、快感缺失等相符合，說明抑郁模型的建立是成功的。

本研究參照文獻[12]，腹腔注射10 mg·kg-1氯胺酮，結果表明，與建模前及抑郁組比較，K組大鼠快感消失、對新環境探索能力和興奮程度的表現得到改善，提示氯胺酮具有明顯的抗抑郁作用，這與既往研究結果一致[3-4]。研究中為保證給藥量的準確，將氟西汀在生理鹽水中加熱溶解，按比例(1.8 mg氟西汀 ∶10 ml生理鹽水)配制成混懸液，參照既往研究以1.8 mg·kg-1進行灌胃[13]。

本研究發現對于CUMS抑郁模型建立成功的大鼠，經氯胺酮聯合氟西汀處理3 d后，其曠場實驗評分、糖水偏好比相對于抑郁模型組及單純使用氟西汀組明顯增加。而此時使用了氟西汀的大鼠與抑郁組大鼠相比無明顯差異。前期動物實驗顯示，氟西汀需5～7 d方能起效，這與本研究結果一致。在給藥7 d后，氯胺酮聯合氟西汀組，其曠場實驗評分、糖水偏好比相對于單純使用氟西汀組明顯增加，提示氯胺酮聯合氟西汀較單獨使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強，抗抑郁起效時間縮短。

本實驗取材選取與抑郁癥關系最為密切的大腦前額葉進行分析，研究結果發現，對于CUMS抑郁模型建立成功的大鼠，經氯胺酮聯合氟西汀處理后，相對于抑郁模型組及單純使用氟西汀組，抑郁行為得到改善，前額葉nNOS蛋白及mRNA水平明顯降低，其配體CAPON蛋白及mRNA水平明顯升高。提示氯胺酮聯合氟西汀可能通過促進抑郁大鼠前額葉神經元CAPON的表達，進而抑制nNOS活性來改善大鼠的抑郁狀態。nNOS是一種主要表達于神經細胞胞質的酶類，可以催化L-精氨酸形成NO，而NO作為神經系統重要的信使分子和神經遞質在抑郁癥的發病中起著重要作用。生理量的NO對神經系統有保護作用，但過量的NO卻會引起神經毒性作用[7]。當 NO過度增加可誘發其生成的正反饋環路激活，進而線粒體損傷，ATP等能量生成減少，隨之出現細胞的損傷及凋亡，嚴重影響細胞的功能。前期多項研究已經證實，NO的神經毒性作用參與了抑郁癥、阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷癥的病理生理過程。既往研究發現[14]，抑郁癥患者血清中存在NO水平升高及NOS活力升高。

NO屬于氣體分子，在細胞中存留時間短(僅2～5 s)，不易準確檢測，故本次研究選用神經型一氧化氮合酶(nNOS)進行檢測，從而反映細胞內NO的濃度。本次研究發現，抑郁大鼠在經氯胺酮及氟西汀治療后，抑郁行為明顯改善，大鼠腦內前額葉nNOS蛋白及mRNA表達明顯減低，提示大鼠抑郁時所出現的NO合成過量受到了抑制。CAPON是nNOS的一種接頭調控蛋白，可與PSD95競爭性結合nNOS，抑制NMDAR對nNOS的激活，減少NO的合成和釋放，從而減少nNOS過度激活產生大量NO而引起的生理或病理作用[15]。

綜上所述，氯胺酮聯合氟西汀較單獨使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強，且抗抑郁起效時間縮短。其機制可能與氯胺酮聯合氟西汀能通過促進抑郁大鼠前額葉神經元CAPON的表達，進而抑制nNOS活性來改善大鼠的抑郁狀態。本研究發現為臨床抑郁癥急性發作的治療提供方向。

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Effects of ketamine plus fluoxetine on nNOS and CAPON expression in the prefrontal lobe of mentally depressed rats

SHEN Yi-wei, LYu Feng, LI Ping, LUO Jie, XIE Fei, MIN Su

(DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To investigate the effect of ketamine plus fluoxetine on depressed behavior and the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and CAPON in prefrontal lobe of mentally depressed rats at different time points,so as to study the possible mechanism of ketamine plus fluoxetine inducing antidepressant behavior. Methods Healthy adult male Sprague-Dawley rats, aged 2.5～3 months, weighing 220～270 g, were induced as the rodent model of depression by chronic unpredictable mild stress (CUMS). After the models of depression were established, 96 of CUMS modeling successfully depressed rats were selected. Then they were randomly divided into four groups (n=24 each): the depressed group (group D, untreated group), ketamine group (group K, treated with intraperitoneal injection of ketamine 10 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days), fluoxetine group (group F, treated with gavage of fluoxetine 1.8 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days), or ketamine plus fluoxetine group (group KF, treated with intraperitoneal injection of ketamine 10 mg·kg-1plus gavage of fluoxetine 1.8 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days). Open field test and sucrose preference test were performed 1 day before depression model was established, and 1 day before and after treatment. The rats were sacrificed 1 day after the last test for determination of the expression of nNOS and CAPON protein (using immuno-histochemisity) and mRNA (by RT-PCR) in the prefrontal lobe. Results After the models of depression were established, the total distance, rearing number and the sucrose preference percentage (SPP) were decreased significantly compared with those before (P<0.05).There was no significant difference among all groups in the total distance, rearing number and the SPP before treatment (P>0.05). Compared with groups D and F, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in groups K and KF, with 3 days’ treatment (P<0.05). Compared with group D, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in groups K,F and KF with 7 days’ treatment (P<0.05). Compared with group F, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in group KF with 7 days’ treatment (P<0.05). Conclusion Co-administration of antidepressant fluoxetine with ketamine may induce a more pronounced antidepressant activity than treatment with each antidepressant alone and it can shorten the time to improve the depressive state through promoting the expression of CAPON and inhibiting nNOS activity in the prefrontal lobe of mentally depressed rats.

ketamine; fluoxetine; depression; prefrontal lobe; nitirc oxide synthase; CAPON

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.018.html

2014-12-06,

2015-02-19

國家自然科學基金面上資助項目(No 30972831, 81271501)；重慶市教育委員會科學技術研究項目(No KJ090309)；重慶市醫學重點學科資助項目(No 2007-02)；衛生部國家臨床重點學科(No 2011-170)

沈一維(1985-) 女，碩士，醫師，研究方向：抑郁癥與認知功能，E-mail:yiwei1928@126.com； 閔 蘇(1960-) 女，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：抑郁癥與認知功能、圍術期內重要臟器保護，通訊作者，Tel：023-89011068，E-mail: ms89011068@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.010

A

1001-1978(2015)04-0487-06

R-332；R322.81； R749.42；R971.2；R971.4；R977.3