氧化苦參堿對高糖毒性下血管內皮細胞的保護作用

易 云,吳 琴,黃莉萍,梁尚棟,高 云

(1.南昌大學第二附屬醫院， 2.南昌大學基礎醫學院生理教研室，江西 南昌 330006)

氧化苦參堿對高糖毒性下血管內皮細胞的保護作用

易 云1,2,吳 琴2,黃莉萍2,梁尚棟2,高 云2

(1.南昌大學第二附屬醫院， 2.南昌大學基礎醫學院生理教研室，江西 南昌 330006)

目的 研究氧化苦參堿對A2B受體介導高糖毒性下人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)保護作用。方法 采用傳代細胞系培養方法培養人臍靜脈血管內皮細胞，細胞分組如下: 5.5 mmol·L-1對照糖組(Control)，22.2 mmol·L-1高糖組 (22.2 mmol·L-1)， 44.4 mmol·L-1高糖組 (44.4 mmol·L-1)；對照糖 + 氧化苦參堿組(control+ OMT)， 22.2 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (22.2 mmol·L-1+ OMT)， 44.4 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (44.4 mmol·L-1+ OMT)。采用MTS法觀察高糖和氧化苦參堿保護效應；結合蛋白印跡、 RT-PCR等方法觀察HUVEC中A2B受體的表達變化。結果 高糖培養可引起HUVEC受損和活性下降。氧化苦參堿(OMT)可明顯減少高糖性HUVEC損傷和活性下降，并對A2B的表達有明顯抑制作用。結論 氧化苦參堿對高糖條件下的HUVEC有保護作用，此作用可能通過抑制A2B的表達而實現。

氧化苦參堿；HUVEC；高糖；細胞毒性；A2B受體；糖尿病

內皮細胞功能紊亂已經成為2型糖尿病及其血管并發癥發生發展的重要使動和關鍵因素，而2型糖尿病長期存在的糖毒性、脂毒性和高血壓又進一步加重內皮細胞功能紊亂[1-2]。腺苷 (adenosine)是人體內的一種重要的生物活性物質，它是腺嘌呤核苷酸的前體和代謝產物，在全身各處組織都可以產生，其中血管內皮組織是產生腺苷較多的組織。腺苷通過4種膜受體A1、A2A、A2B和A3來調節許多生理過程。生理狀態下，基礎水平的腺苷主要激活 A2A受體，當腺苷水平上升并超過生理水平或達到病理水平時 A2B才被激活。A2B受體與腺苷及其類似物結合后，通過跨膜信號傳遞途徑激活腺苷酸環化酶，使環磷酸腺苷(cAMP)形成增加，進而擴張血管平滑肌和抑制中性粒細胞的毒性作用，激活肥大細胞等炎癥細胞釋放細胞因子及炎癥介質[3]。有研究發現，A2B受體在血管內皮細胞有表達，并可能對內皮細胞功能有著調節作用。目前對腺苷A2B受體與糖尿病血管內皮功能紊亂的研究非常少。

氧化苦參堿(oxymatrine, OMT) 是從豆科槐屬植物苦參(sophora flavescens Ait.) 等中提取的生物堿，具有四環的喹嗪啶類結構。氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用。可產生抗炎和擴血管作用[4-6]，提示其可能對高糖、高脂引起的血管內皮損傷可能產生保護作用。

本實驗以D-Glucose合并無糖培養基建立高糖模型，研究在高糖條件下,氧化苦參堿對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECS)的細胞毒性和保護作用及其作用機制,以進一步闡述氧化苦參堿對A2B受體在高糖條件介導的保護作用機制,為由血管內皮功能紊亂引起的各種糖尿病并發癥的防治探尋新靶點,也為氧化苦參堿用于糖尿病及其并發癥的預防和治療提供新的實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVECS)，購自江蘇南京，實驗采用第3～9代。

1.1.2 氧化苦參堿 氧化苦參堿購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試劑 RPMI 1640培養基(批號：11875，Gibco，美國)；胎牛血清(批號：12483020，Invitrogen，英國)；0.25%胰酶(批號：T1300-100，Solarbio，中國)；cell Titer96(批號：G3582，Promega，美國)；二甲基亞砜(DMSO) (批號：0231，Amresco，中國)；總RNA提取試劑盒(批號：DP419，TIANGEN，中國)；RT試劑盒(批號：AT301，TransGEN，中國)；熒光定量試劑盒(批號：RR820A，TaKaRa，日本)；其他試劑均為國產分析純，水為自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HUVECS細胞培養于RPMI 1640培養液中，其中含10%胎牛血清，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 mg·L-1，37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 實驗設計及分組 將HUVECS細胞分成6個組，5.5 mmol·L-1對照糖組(Control)，22.2 mmol·L-1高糖組 (22.2 mmol·L-1)， 44.4 mmol·L-1高糖組 ( 44.4 mmol·L-1)；對照糖 + 氧化苦參堿組(control+ OMT)， 22.2 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (22.2 mmol·L-1+ OMT)， 44.4 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (44.4 mmol·L-1+ OMT)。

1.2.3 MTS法檢測氧化苦參堿對HUVECS細胞活性的影響 水浴37℃解凍MTS試劑，96孔板中每孔加入20 μl的MTS試劑，37℃，5% CO2孵育1～4 h，如為了延長檢測時間，每孔加入25 μl 10%SDS來終止反應，等到后續檢測，多功能酶標儀選取490 nm波長進行檢測。

1.2.4 實時熒光定量核酸擴增(qPCR) 按說明書完成總RNA的提取和cDNA的合成。本實驗選用GAPDH作為內參，引物序列如下：

Primer A2B產物長度為83bp

F 5′-ACCGAGACTTCCGCTACACTT-3′

R 5′-CTGACCATTCCCACTCTTGAC-3′

Primer GAPDH 產物長度為138bp

F 5′-CAGGAGGCATTGCGTATGAT-3′

R 5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′

A2B和GAPDH擴增體系分別如下：GoTaq@qPCR Master Mix，2× 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.2 μL，無RNase水 7 μL。PCR反應條件：95℃×2 min；95℃×15 s，60℃×60 s，共40個循環；72℃×5 min。將PCR反應板放入ABI7500系統，設置好運行程序，運行完后保存結果分析。

1.2.5 Western blot 將6孔板從培養箱取出，放到冰上靜置，移除培養基，用滅菌的PBS清洗兩遍( 去除酚紅)，每孔加1 mL 細胞裂解液(含10%PMSF)，在冰上充分裂解30 min后，轉移至1.5 mL離心管，以12 000 r·min-1于4℃離心15 min，按比例加入5×loading buffer和DTT，混勻后煮沸5 min，使蛋白變性，取上清，分裝于0.5 mL離心管中，并置于-20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉膜。一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST清洗3次，二抗(1 ∶2 000)室溫震蕩孵育，TBST清洗3次。膜加ECL發光劑反應，X光膠片顯影定影后光密度分析。通過Image-J圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測得的光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組A2B的蛋白表達量。

2 結果

2.1 MTS檢測HUVECs細胞活性確定OMT濃度從加OMT后培養d 3檢測HUVECs細胞活性發現，10和30 μmol·L-1組與Control組、1和3 μmol·L-1組相比細胞活性明顯降低，且差異有顯著性 (P<0.01，見Fig 1)。結果表明，1和3 μmol·L-1組對細胞活性影響不大，根據參考文獻，我們選定OMT細胞干預濃度為3 μmol·L-1。

2.2 MTS測定高糖對HUVECs細胞毒性和OMT對其的保護作用從加高糖后培養d 3 MTS檢測高糖對細胞毒性以及OMT后發現， 22.2和44.4 mmol·L-1組與Control組相比細胞活性明顯降低，且差異有顯著性 (P<0.01)，但是Control組、Control+OMT組、22.2和44.4 mmol·L-1+OMT組三者之間相比差異無顯著性 (P>0.05，見Fig 2)

Fig 1 Viability of HUVECs in different oxymatrine

The HUVECs in 1,3,10 μmol·L-1and 30 μmol·L-1groups were given different concentrations of OMT for 3 days from d1 after seeding the cells in 6 cells plate,**P<0.01vscontrol group.

Fig 2 Effect of oxymatrine on viability of HUVECs

The HUVECs were given different concentrations of glucose or 3 μmol·L-1OMT for 3 days from d1 after seeding the cells in 6 cells plate.**P<0.01vscontrol group.

2.3 qPCR檢測A2B受體情況A2BqPCR結果表明：22.2、44.4 mmol·L-1組中A2B受體mRNA表達水平較Control組明顯增加(P<0.01)；22.2 mmol·L-1+OMT組A2B受體mRNA表達水平較22.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.01)；44.4 mmol·L-1+OMT組A2B受mRNA表達水平較44.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05，見Fig 3)。

Fig 3 Effect of oxymatrine on expression of A2B receptor in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cultivated

A2Bexpression in mRNA level was detected by qPCR.△△P<0.01, 22.2 and 44.4 mmol·L-1vscontrol group;**P<0.01vs22.2 mmol·L-1group;#P<0.05vs44.4 mmol·L-1group.

2.4 Western blot應用ImageJ系統軟件分析A2B受體蛋白印跡結果如下：22.2、44.4 mmol·L-1組中A2B受體蛋白表達水平較Control組明顯增加(P<0.01)； 22.2 mmol·L-1+OMT組A2B受體蛋白表達水平較22.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)；44.4 mmol·L-1+OMT組A2B受體蛋白表達水平較44.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05,見Fig 4)。

3 討論

2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)是胰島素分泌絕對或相對不足，并以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，其中大血管病變直接影響糖尿病患者的預后與生存[7-8]。在糖尿病心血管并發癥中，血管內皮細胞起著關鍵的作用。血管內皮細胞可通過分泌一系列生物活性物質，如前列環素、血管內皮舒張因子、內皮素及血管性假血友病因子等，參與炎癥及免疫反應，也參與腫瘤轉移、血栓形成、血管壁病變等病理過程[9-10]。高血糖環境下，血管內皮細胞發生病變，其分泌活性隨之改變[11]。

腺苷 (adenosine)是人體內的一種重要的生物活性物質，對細胞的功能起到重要調節作用[12-13]。其受體被分為4個亞型:A1、A2A、A2B和A3，其中的A2B受體被發現在血管內皮細胞有表達，并可能參與調節血管內皮細胞促炎癥反應[14-16]。Figler等[14]研究表明，糖尿病狀態下血管內皮細胞A2B受體表達出現增強，導致炎癥因子IL-6分泌增多。A2B受體發揮促炎作用已被證明存在于小鼠肺部炎癥模型以及受哮喘或慢性阻塞性肺病患者[18-20]。A2B受體可促進慢性肺部疾病病理過程的多種促炎介質(如IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-19和單核細胞趨化蛋白1)的表達和釋放[21-22]。以上研究都表明A2B受體可能對血管內皮細胞功能具有重要調節作用[23-24]。我們實驗室的實驗顯示，高糖引起人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)A2B受體表達明顯增高，此結果和Figler等結果相一致。

Fig 4 Effect of oxymatrine on expression of A2B receptor in HUVECs cultivated in glucose ±s,n=6)

A2Bexpression in protein level was detected by Western blot. The stain values (integrated optical density) of A2Bprotein expression (normalized to each β-actin internal control) were determined by image analysis.△△P<0.01, 22.2 mmol·L-1and 44.4 mmol·L-1vscontrol group;*P<0.05vs22.2 mmol·L-1group;#P<0.05vs44.4 mmol·L-1group.

血管內皮功能紊亂是糖尿病血管并發癥發生的基礎[25]。對于糖尿病患者治療的最終目的是預防和延緩糖尿病各種慢性并發癥，而改善內皮細胞功能，已成為治療糖尿病患者的目標之一。氧化苦參堿(oxymatrine, OMT) 是從豆科槐屬植物苦參(Sop hora flavescens ait.) 等中提取的生物堿，具有四環的喹嗪啶類結構。氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用[26-27]，可產生抗炎和擴血管作用[28-29]，提示其可能對高糖、高脂引起的血管內皮損傷產生保護作用。本實驗顯示，高糖培養3 d能引起人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的活性下降，用氧化苦參堿(3 μmol·L-1)干預后能明顯改善，實驗表明人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)在高糖毒性下腺苷A2B受體表達與正常對照組比較存在明顯差異，提示腺苷A2B受體與糖尿病血管內皮功能病變有關。用氧化苦參堿干預發現干預組腺苷A2B受體表達與高糖組比較存在明顯差異，qPCR和蛋白印跡結果顯示：隨著高糖濃度的增高，A2B受體表達水平明顯增強，氧化苦參堿干預后，A2B受體表達下降，細胞活性明顯要比高糖處理的細胞活性要好，提示氧化苦參堿對腺苷A2B受體在高糖條件介導的人血管內皮細胞具有一定的保護作用。

本實驗通過細胞及分子水平相結合的研究，觀察到氧化苦參堿對在高糖條件下人血管內皮細胞有保護作用，可能通過抑制A2B受體表達的升高產生保護作用。相信通過深入了解氧化苦參堿對A2B受體在高糖條件介導的保護作用機制，能夠為因血管內皮功能紊亂引起的各種糖尿病并發癥的防治探尋新靶點，為氧化苦參堿用于糖尿病及其并發癥的預防和治療提供新的實驗依據和理論基礎。

[1] Canivell S, Gomis R. Diagnosis and classification of autoimmune diabetes mellitus[J].AutoimmunRev, 2014, 13(4-5): 403-7.

[2] American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J].DiabetesCare, 2013, 36(Suppl 1): S67-74.

[3] Jolly S E, Noonan C J, Roubideaux Y D, et al. Albuminuria among Alaska Natives--findings from the Genetics of Coronary Artery Disease in Alaska Natives (GOCADAN) study[J].NephronClinPract, 2010,115(2): p. c107-13.

[4] 黃彩云, 黃勝英,謝世榮,等.氧化苦參堿抗心律失常作用的實驗研究[J].大連醫科大學學報,2001,23(4):262-263,269

[4] Hang C Y, Huang S Y, Xie S R, et al. Experimental study oantiarrhythmic effects of oxymatrine[J].JDalianMedUn,2001,23(4):262-263,269.

[5] 孫宏麗, 徐超千,李 哲,等.氧化苦參堿對豚鼠單個心室肌細胞胞漿[Ca2+]i的影響[J]. 中國藥學雜志,2004, 39(4):264-6.

[5] Sun H L, Xu C Q,Li Z, et al. Effect of oxymatrineon[Ca2+]iinsingle ventricular myocyte of guineapigs[J].ChinPharmacolJ,2004,39(4):264-6.

[6] 程 鋼,秦媛媛,程 迪,等.氧化苦參堿對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用及其抑制凋亡的作用機制[J]. 中國藥理學通報,2013,29(3):387-92.

[6] Cheng G,Qin Y Y,Cheng D,et al.Protection of oxymatrine on focal crerebral ischemic injury in rats and its mechanism of inhibition of opoptosis[J].ChinPharmacolBull,2013,29(3):387-92.

[7] Liu S.Prevalence of diabetes and impaired fasting glucose in Chinese adults, China National Nutrition and Health Survey, 2002[J].PrevChronicDis, 2011, 8(1): A13.

[8] Consoli C, Martelli E, D'Adamo M, et al. Insulin resistance affects gene expression in endothelium[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2008,28(2): e7-9.

[9] Tan K C, Chow W S, Tam S C, et al. Atorvastatin lowers C-reactive protein and improves endothelium-dependent vasodilation in type 2 diabetes mellitus[J].JClinEndocrinolMetab, 2002,87(2):563-8.

[10] Tan K C, Wat N M, Tam S C, et al. C-reactive protein predicts the deterioration of glycemia in chinese subjects with impaired glucose tolerance[J].DiabetesCare, 2003,26(8):2323-8.

[11] Stehouwer C D, Gall M A, Twisk J W, et al., Increased urinary albumin excretion, endothelial dysfunction, and chronic low-grade inflammation in type 2 diabetes: progressive, interrelated, and independently associated with risk of death[J].Diabetes, 2002,51(4):1157-65.

[12] Bibli S I, Iliodromitis E K, Lambertucci C, et al. Pharmacological postconditioning of the rabbit heart with non-selective, A, A2Aand A3adenosine receptor agonists[J].JPharmPharmacol, 2014.

[13] Mehta A A, Gupta A S, Ahmed S, et al. Diagnostic utility of adenosine deaminase in exudative pleural effusions[J].LungIndia, 2014,31(2):142-4.

[14] Trincavelli M L, Giacomelli C, Daniele S, et al. Allosteric modulators of human A2B adenosine receptor[J].BiochimBiophysActa, 2014,1840(3):1194-203.

[15] Eltzschig H K, Bonney S K,Eckle T. Attenuating myocardial ischemia by targeting A2Badenosine receptors[J].TrendsMolMed, 2013, 19(6): 345-54.

[16] Nishida K, Dohi Y, Yamanaka Y, et al. Expression of adenosine A2b receptor in rat type Ⅱ and Ⅲ taste cells[J].HistochemCellBiol, 2014,141(5):499-506.

[17] Figler R A, Wang G, Srinivasan S, et al. Links between insulin resistance, adenosine A2B receptors, and inflammatory markers in mice and humans[J].Diabetes, 2011,60(2): 669-79.

[18] Kolachala V, Ruble B,vijay-kumar M,et al. Blockade of adenosine A2Breceptors ameliorates murine colitis[J].BrJPharmacol, 2008, 155(1): 127-37.

[19] Li J, Li J, Yue Y, et al. Genistein suppresses tumor necrosis factor alpha-induced inflammation via modulating reactive oxygen species/Akt/nuclear factor kappaB and adenosine monophosphate-activated protein kinase signal pathways in human synoviocyte MH7A cells[J].DrugDesDevelTher, 2014,8:315-23.

[20] Antonioli L, Fornai M, Awwad O, et al. Role of the A(2B) receptor-adenosine deaminase complex in colonic dysmotility associated with bowel inflammation in rats[J].BrJPharmacol, 2014,171(5):1314-29.

[21] Elsherbiny N M,Al-Gayyar M M. Adenosine receptors: new therapeutic targets for inflammation in diabetic nephropathy[J].InflammAllergyDrugTargets, 2013,12(3):153-61.

[22] Antonioli L, Blandizzi C, Pacher P, et al. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine[J].NatRevCancer, 2013,13(12): 842-57.

[23] Ponnoth D S，Jamal Mustafa S. Adenosine receptors and vascular inflammation[J].BiochimBiophysActa, 2011,1808(5):1429-34.

[24] Csoka B,Hasko G. Adenosine, inflammation pathways and therapeutic challenges[J].JointBoneSpine, 2011,78(1):4-6.

[25] Csóka B, Koscsó B, T?ro G, et al. A2B adenosine receptors prevent insulin resistance by inhibiting adipose tissue inflammation via maintaining alternative macrophage activation[J].Diabetes, 2014,63(3):850-66.

[26] Zhu B, Yang J R, Chen S F, Jiang Y Q. The Attenuation of Lung Ischemia Reperfusion Injury by Oxymatrine[J].CellBiochemBiophys, 2014,70(1):333-6.

[27] Zhang Y, Sun S, Chen J, et al. Oxymatrine induces mitochondria dependent apoptosis in human osteosarcoma MNNG/HOS cells through inhibition of PI3K/Akt pathway[J].TumourBiol, 2014,35(2):1619-25.

[28] Guo C, Han F, Zhang C, et al. Protective effects of oxymatrine on experimental diabetic nephropathy[J].PlantaMed, 2014,80(4): p. 269-76.

[29] Wang S B,Jia J P. Oxymatrine attenuates diabetes-associated cognitive deficits in rats[J].ActaPharmacolSin, 2014, 35(3): 331-8.

Protective effect of oxymatrine on vein endothelial cell from glucose toxicity

YI Yun1,2, WU Qin2, HUANG Li-ping2, LIANG Shang-dong2, GAO Yun2

(1.TheDepartmentofScienceandTechnology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,2.DeptofPhysiology,BasicMedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To study the effect of oxymatrine (OMT) on protecting human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) from toxicity induced by high glucoseinvitro. Methods The HUVECs were cultured with medium containing different concentrations of glucose or OMT. The cells were randomly divided into 6 groups: 5.5 mmol·L-1control group(Control), 22.2 mmol·L-1high glucose (22.2 mmol·L-1), 44.4 mmol·L-1high glucose (44.4 mmol·L-1), control + OMT(control+ OMT), 22.2 mmol·L-1high glucose + OMT(22.2 mmol·L-1+ OMT), 44.4 mmol·L-1high glucose+OMT (44.4 mmol·L-1+ OMT). The protective effect of oxymatrine was assessed by MTS assays. The expression of A2Bin HUVECs was detected by Real-time quantitative PCR (qPCR) and Western Blot methods. Results The glucose was shown to have caused cytotoxicity in HUVECs. Oxymatrine (3 μmol·L-1) was found to have protected HUVECs from glucose toxicity effectively, and reduced the expression of A2Bsignificantly. Conclusion Oxymatrine can obviously protect HUVECs from cytotoxicity induced by high glucose and the effect is performed partly by decreasing A2Bexpression.

oxymatrine; human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); high glucose; cytotoxicity; A2Breceptor; diabetes

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.020.html

2014-12-12,

2015-02-24

國家自然科學基金資助項目(No 81100829, 81360136)；江西省青年科學家培養計劃資助項目(No 2BCB22001)；江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃資助項目(No 2BCB22001)

易 云(1985-)，男，碩士，研究方向：生理學和藥理學，E-mail: yiyun.2010@163.com； 吳 琴(1985-)，女，碩士，研究方向：生理學和藥理學,共同第一作者，E-mail: 271872335@qq. com； 高 云(1973-)，女，博士，教授，博士生導師，生理學碩導，研究方向：神經藥理學，通訊作者，E-mail:gaoyun90 @163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.012

A

1001-1978(2015)04-0499-05

R284.1；R322.12；R329.24；R392.11；R587.1