促腎上腺皮質激素釋放激素受體1拮抗劑CP154526對大鼠海馬神經元凋亡的影響

周 毅，劉 巍，張 悅

(河北醫科大學 1.第二醫院神經內科、2.病理學教研室、3.臨床診斷學教研室，河北 石家莊 050017)

促腎上腺皮質激素釋放激素受體1拮抗劑CP154526對大鼠海馬神經元凋亡的影響

周 毅1，劉 巍2，張 悅3

(河北醫科大學 1.第二醫院神經內科、2.病理學教研室、3.臨床診斷學教研室，河北 石家莊 050017)

目的 觀察促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)受體1拮抗劑CP154526對海馬神經元凋亡的影響。方法 原代培養大鼠海馬神經元，噻唑藍(MTT)法測定細胞存活率，然后分為4組：正常對照組(Con)、CRH刺激組(CRH)、CRH和CP154526共同刺激組(CRH+CP)、CP154526刺激組(CP)。TUNEL、流式細胞術Annexin Ⅴ-PI法檢測神經元凋亡率；Western blot檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達水平。結果 10-8mol·L-1的CRH作用于海馬神經元后，細胞存活率下降(P<0.05)；50 mmol·L-1的CP154526可明顯提升神經元存活率(P<0.05)。與正常對照組相比，CRH刺激后神經元凋亡率增加，Bax/Bcl-2比值增高，caspase-3表達增加；加用CP154526可明顯降低神經元凋亡率、Bax/Bcl-2比值及caspase-3表達水平；而單獨應用CP154526對凋亡沒有明顯影響。結論 一定濃度的CRH可誘導海馬神經元細胞凋亡，其受體1拮抗劑CP154526可有效減輕細胞凋亡，發揮神經保護作用。

促腎上腺皮質激素釋放激素；CP154526；海馬；神經元；凋亡；原代培養

應激是指機體在受到內外環境因素及社會、心理因素刺激時所出現的全身性非特異性適應反應，其主要特征是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)的激活為核心的生理和心理反應。促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)是下丘腦分泌的調節HPA軸功能的多肽類激素，也是機體應激反應時發揮神經內分泌調節的關鍵激素[1]。近年來發現，CRH不僅在HPA軸調節中起著重要作用，作為一種神經遞質，其在情緒反應、學習記憶和神經系統損傷與發育中也發揮著重要作用[2]。我們前期的研究發現，一定濃度的CRH可以降低海馬神經元細胞存活率，并且呈現出濃度和時間依賴模式[3]。CRH通過其受體發揮生物學作用，CRH受體1(CRH-R1)主要表達于哺乳動物的中樞神經系統中，如下丘腦、海馬、大腦皮層、杏仁體、藍斑等部位，與CRH有較高的親和力[4]。在應激狀態下，CRH主要通過CRH-R1發揮內分泌、行為改變和內臟反應等功能的調節作用[5-7]，但有關CRH-R1發揮作用的方式尚不清楚。本實驗應用CRH-R1拮抗劑CP154526，重點探討其對海馬神經元凋亡的影響，以期明確CRH-R1在CRH誘導神經元凋亡中的作用，為應激所致精神損傷的防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新生24 h內SD大鼠，♂♀不限，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基(Gibco)、胎牛血清(Cellgro)、Neurobasal培養基(Gibco)、B27(PAA)。CRH(Anaspec)，CP154526(Tocris Bioscience，Bristol)，0.25%胰蛋白酶(Sigma)，四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma)。兔抗MAP2一抗(Cell Signaling)，兔抗Bax、Bcl-2多克隆抗體(Protein Tech)，鼠抗caspase3單克隆抗體(Cell Signaling)，FITC標記的IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。TUNEL試劑盒(Roche)。Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒(聯科生物)。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元原代培養 新生24 h內SD乳鼠，75%乙醇消毒，無菌條件下斷頭、取雙側海馬，解剖顯微鏡下去除血管及腦膜，剪碎后以0.125%胰蛋白酶消化15 min，含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，1 mm口徑吸管吹打均勻，細胞計數，稀釋成1×106ml-1的細胞懸液，接種于6孔培養板(預先經0.1%多聚賴氨酸鋪底)，將培養板置于37℃、5%CO2培養箱內，3 h后補種植液，24 h后去除種植液，加入培養液(Neurobasal+B27)培養，每3 d換液，培養6～8 d神經細胞之間突觸聯成網狀用于后續研究[8]。

1.2.2 神經元鑒定 取培養7 d海馬神經元，70%酒精固定30 min，0.1%Triton 37℃孵育15 min，3%H2O2去除內源性過氧化物酶，山羊血清封閉30 min，兔抗MAP2一抗1 ∶200稀釋，4℃過夜，FITC標記的山羊抗兔二抗37℃孵育2 h，PBS沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.3 MTT檢測細胞存活率 細胞懸液200 μL接種于96孔培養板中，加入不同濃度的CRH(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)作用48 h后，每孔加5 g·L-1MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后小心吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl-sulfoxide, DMSO)振蕩10 min，490 nm波長測定各孔吸光度值(A值)，計算細胞存活率。存活率/%=實驗組A值/空白對照組A值×100%。實驗重復3次，找到誘導海馬神經元存活率降低的CRH的最低敏感濃度。

用神經元培養液將CRH受體1特異性拮抗劑CP154526稀釋至10、50、250 mmol·L-1的終濃度，與CRH共同刺激海馬神經元48 h，上述同樣方法檢測神經元存活率，找到CP154526的最低敏感濃度。

1.2.4 實驗分組 后續實驗分為4組：(1)空白對照組：神經元培養液正常培養；(2)CRH組：用MTT結果中CRH誘導海馬神經元凋亡的最低敏感濃度培養；(3)CRH+CP組：加入CRH同時加入CRH受體1拮抗劑CP154526；(4)CP組：只加入CP154526培養。各組培養液量一致，均培養48 h。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡率 以末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法，按試劑盒說明進行細胞凋亡檢測，DAPI復染細胞核。凋亡神經元細胞核呈綠色熒光。每張切片于凋亡細胞分布區域隨機選取10個高倍視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數，以百分數(%)表示凋亡百分率。

1.2.6 流式細胞術檢測 用0.25%胰蛋白酶制備單細胞懸液，用膜聯蛋白V (Annexin V) / 碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染色標記法進行流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

1.2.7 Western blot檢測海馬神經元Bax、Bcl-2、caspase-3表達 收集各組細胞提取總蛋白，每組樣品取50 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入一抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶200)、caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠IgG(1:5000)，37℃孵育2 h，TTBS洗膜，滴加ECL發光劑，于Odyssey FC成像系統中顯影，并對條帶進行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結果。

2 結果

2.1 原代培養海馬神經元的形態特征及鑒定倒置顯微鏡下可見，原代培養海馬神經元7 d時神經元胞體豐滿，周圍光暈明顯，立體感強，突起增粗增長，連接成網狀(Fig 1A)，顯示神經元成熟。Fig 1B所示為神經元特異性標志物MAP2免疫熒光染色，可見神經元胞體和突起著色，經鑒定神經元純度在90%以上，可用于后續實驗研究。

Fig 1 Primary culture and immunofluorescence identification of hippocampal neuron

A: morphological characteristics of primary cultivated hippocampal neuron(×200); B: the immunofluorescence identification of hippocampal neuron (×200).

2.2 MTT檢測神經元存活率以正常對照組細胞存活率為100%計算，不同濃度的CRH刺激海馬神經元后，隨著濃度的增大，細胞存活率呈下降趨勢；與正常對照組相比，濃度為10-8mol·L-1的CRH刺激后，細胞存活率降低即具有統計學意義(P<0.05，Fig 2A)，故CRH導致神經元存活率降低的最低敏感濃度為10-8mol·L-1。

將不同濃度的CRH受體1特異性拮抗劑CP154526分別加入10-8mol·L-1CRH刺激的神經元培養基中，可見，隨著濃度的增大，細胞存活率有所升高，與CRH組相比，50 mmol·L-1的CP154526可明顯提升神經元存活率(P<0.05，Fig 2B)。

Fig 2 Cell viability assayed by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsCRH.

2.3 TUNEL檢測凋亡率TUNEL染色可見，與正常對照組相比，10-8mol·L-1的CRH刺激后凋亡細胞明顯增加(P<0.05)，加用50 mmol·L-1的CP154526后，凋亡細胞明顯減少(P<0.05)。單獨應用CP154526，和正常對照組相比，凋亡細胞沒有明顯變化，見Fig 3。

2.4 流式細胞術檢測凋亡率Annexin Ⅴ是檢測細胞早期凋亡的敏感指標之一。流式細胞儀將收集到的細胞分為四個象限，左下象限代表的是活細胞，右下象限代表的是早期凋亡細胞，右上象限代表的是晚期凋亡細胞。早期凋亡和晚期凋亡比率之和作為總的凋亡率。如Fig 4所示，與正常對照組相比，CRH刺激后神經元凋亡率明顯增加(P<0.05)；加用CP154526后，凋亡率明顯降低(P<0.05)；而單獨應用CP154526，與正常對照組相比，神經元細胞凋亡率沒有明顯變化(P>0.05)。

2.5 Western blot檢測海馬神經元Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達結果與正常對照組相比，CRH刺激后，凋亡標志蛋白Bax表達增加，Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；caspase-3蛋白表達增加(P<0.05)。加用CP154526后，Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)；caspase-3表達也明顯降低(P<0.05)。而單獨應用CP154526，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白水平與對照組相比均無統計學意義(P>0.05),見Fig 5。

Fig 3 Neuron apoptotic rates of different groups examined by TUNEL(CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

3 討論

應激反應中，HPA軸激活的中樞控制是十分復雜的，在這一系列神經內分泌調節過程中，下丘腦合成和釋放的CRH起著關鍵作用，它控制著HPA軸的興奮水平。隨著對應激反應研究的深入，發現CRH還是一種重要的神經遞質，在情緒反應、學習記憶和神經系統損傷與發育中也有著重要作用[2]。

海馬是邊緣系統的重要組成部分，是HPA軸應激反應的高位調節中樞，參與了情緒、學習和記憶、行為、免疫等的調節，對應激反應非常敏感且易損，它的損傷在各種應激所致疾患中起到關鍵作用。研究表明，慢性應激可能通過增加海馬神經元細胞凋亡，導致海馬損害，從而誘發抑郁癥[9-10]。因為位于海馬CA1區的錐體細胞表達糖皮質激素受體，而應激狀態下，腎上腺分泌的糖皮質激素可以通過血腦屏障作用于這些受體，因此，很多學者認為糖皮質激素及其受體介導應激對海馬功能產生影響[11]。但是，當腎上腺切除后，慢性應激一樣可以影響海馬功能。越來越多的研究結果顯示，CRH及其受體參與介導應激對海馬結構和功能產生影響[12]。

Fig 4 Neuron apoptotic rates of different groups examined by Annexin V/PI(CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

目前已知的CRH受體有3種，即CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3，均屬于G蛋白偶聯受體。3種受體的功能及與CRH的親和力不盡相同。其中CRH-R1由415～420個氨基酸組成，與CRH有較高的親和力。CRH-R1 mRNA主要表達于哺乳動物的中樞神經系統中，如下丘腦、海馬、大腦皮層、杏仁體、藍斑等部位，在外周的表達極其有限[4]。大量研究表明，在應激狀態下，CRH主要通過CRH-R1發揮內分泌、行為改變和內臟反應等功能的調節作用[5-7]。CRH-R2序列與CHR-R1有約70%的同源性，其在中樞神經系統表達有限，而在外周主要表達在心肌、骨骼肌、胃腸道等部位[13]。CRH-R3最早于2001年被分離出來，由428個氨基酸序列組成，但有關其分布、特性及作用尚不清楚[14]。

Fig 5 Protein expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in different groups examined by Western blot (CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

關于CRH受體在應激中的作用，有研究報道，應用CRH-R1基因敲除鼠，基礎和應激狀態下HPA軸功能明顯受損。而邊緣系統CRH-R1對調控應激時HPA軸反應至關重要[15]。我們前期研究發現，一定濃度的CRH可以降低海馬神經元細胞存活率，但CRH的作用是否是通過其受體1來發揮的，及其具體的作用機制尚不清楚。本實驗中，我們應用TUNEL、流式Annexin Ⅴ-PI雙標染色、Western blot等方法進一步證實，CRH可以導致體外原代培養的大鼠海馬神經元細胞凋亡增加，應用CRH-R1特異性拮抗劑CP154526可以有效的降低神經元凋亡率，說明CRH-R1確實在CRH誘導神經元凋亡的過程中發揮了重要作用。

關于CP154526降低神經元凋亡的可能原因，目前尚無明確報道。我們考慮， 可能與CP154526高度親脂性及其半衰期較長有關，使得CP154526可與CRH-R1充分結合，從而抑制了CRH的作用。當然，細胞內調控凋亡的信號系統精細復雜，CP154526具體是如何發揮其調控作用的將是我們下一步研究的重點。

上述實驗結果說明，應激狀態下，一定濃度的CRH可通過其受體1誘導神經元細胞凋亡，而CP154526對神經細胞的凋亡具有一定的抑制作用，可為應激所致精神損傷的細胞保護治療提供新的思路。

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Effects of CP154526,the corticotropin releasing hormone receptor 1 antagonist,on rat hippocampal neuron apoptosis

ZHOU Yi1, LIU Wei2, ZHANG Yue3

(1.DeptofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China, 2.DeptofPathologyHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China, 3.DeptofClinicalDiagnostics,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Aim To investigate the effects of CP154526, a corticotropin releasing hormone (CRH) receptor 1 antagonist, on the hippocampal neuron apoptosis. Methods Rat hippocampal neurons were primarily cultured. Cell viability was estimated using MTT assays. Neurons were randomly divided into four groups: Normal cultures (Control); CRH-exposed cultures (CRH); CRH and CP154526 co-exposed cultures (CRH+CP); CP154526-exposed cultures (CP). Cell apoptosis was examined by TUNEL or flow cytometry Annexin Ⅴ-PI staining. The protein levels of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were investigated by Western Blotting. Results 10-8mol·L-1CRH decreased cell viability of cultured hippocampal neuron (P<0.05), while 50 mmol·L-1CP154526 significantly increased neuron viability (P<0.05). Compared with Control group, cell apoptotic rate, the ratio of Bax and Bcl-2 and the protein level of Caspase-3 were elevated in hippocampal neuron induced by CRH. Combined with CP154526 reversed the effects of CRH. Application of CP154526 alone had no obvious effects on cell apoptosis. Conclusions A certain concentration of CRH can induce hippocampal neuron apoptosis, and its receptor 1 antagonist CP154526 can effectively reduce the apoptosis and play a neuroprotective role.

CRH; CP154526; hippocampus; neuron; apoptosis; primary culture

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.021.html

2014-11-09,

2015-01-23

國家自然科學基金資助項目(No 81302625)；河北省高等學校科學技術研究優秀青年基金項目(No Y2012001)

周 毅(1978-)，男，碩士，主治醫師，研究方向：神經系統疾病，Tel：0311-86265661，E-mail：lwei929@126.com； 張 悅(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：神經系統疾病，通訊作者，Tel：0311-86265661，E-mail：zhyue515@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.013

A

1001-1978(2015)04-0504-06

R-332；R322.81；R329.25；R392.11；R977.11