Salinomycin對乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/DOX的增殖抑制作用及機制

劉 浩，盧敏瑩，賀智敏

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，廣東 廣州 510095)

Salinomycin對乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/DOX的增殖抑制作用及機制

劉 浩，盧敏瑩，賀智敏

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，廣東 廣州 510095)

目的 本研究旨在探討Salinomycin對乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/DOX增殖和凋亡的影響及可能作用機制。方法 MTS實驗檢測Salinomycin對MCF-7/DOX細胞增殖的影響；Annexin V-FITC/PI染色檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞凋亡的影響；DCFH-DA染色檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)產生的影響；JC-1法測定細胞線粒體膜電位；Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白BAX、BCL-2、caspase-3和caspase-9的表達變化。結果 Salinomycin能明顯抑制MCF-7/DOX耐藥細胞增殖，且具有濃度依賴性；流式分析發現Salinomycin能夠誘導MCF-7/DOX細胞凋亡，增加細胞內ROS水平，降低細胞線粒體膜電位；與對照組相比較，Salinomycin處理明顯抑制BCL-2的表達，上調BAX、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表達；抗氧化劑N-acetylcysteine(NAC)則逆轉上述作用。結論 Salinomycin能夠誘導MCF-7/DOX細胞凋亡，其機制可能與Salinomycin誘導ROS的產生，激活線粒體凋亡途徑有關。

乳腺癌；Salinomycin；阿霉素耐藥；細胞凋亡；活性氧；線粒體膜電位

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，我國女性乳腺癌發病率逐年升高，并有逐步年輕化的趨勢[1]。目前化療仍是乳腺癌臨床治療的主要方法之一。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種周期非特異性廣譜抗癌藥，對各期細胞均有作用，具有很強的抗癌活性，廣泛應用于包括乳腺癌在內的臨床各類腫瘤化療中。然而，研究表明乳腺癌細胞易對阿霉素產生耐藥，導致化療失敗，從而使阿霉素在乳腺癌治療的應用中受到很大限制[2]。

Salinomycin是由白色鏈球菌(streptomyces albus)經發酵培養產生的一種一元羧酸聚醚類離子載體型抗生素類，具有殺菌、抑菌的作用[3]。自2009年，Gupta等[4]發現Salinomycin能選擇性抑制乳腺癌干細胞以來，Salinomycin的抗腫瘤作用越來越受到關注。隨后多項研究表明， Salinomycin能夠誘導結直腸癌[5]、肺癌[6]、前列腺癌[7]等多種腫瘤細胞的凋亡。此外，研究發現Salinomycin能夠逆轉人白血病KG-1a細胞的耐藥性[8]，然而相關機制還有待進一步明確。

本實驗旨在研究Salinomycin對體外培養的乳腺癌阿霉素耐藥細胞MCF-7/DOX的增殖抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；Salinomycin購自Selleck公司；P-gp、BCL-2、BAX、caspase-3、caspase-9抗體購自CST公司；P-gp，β-actin抗體購自Santa Cruz公司；預染蛋白質Marker購自Fermentas公司；HRP標記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術有限公司；NAC、cyclosporine A、Doxorubicin、DCFH-DA、JC-1購自Sigma公司；MTS購自Promega公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。ECL化學發光底物試劑盒購自Pierce公司；Quick Start Bradford蛋白定量試劑購自Bio-Rad公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養人乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃、5% CO2的培養箱內飽和濕度培養。將MCF-7/DOX細胞暴露于低劑量[1/10的半數抑制濃度(50% concentration of inhibition, IC50)]的阿霉素中維持細胞耐藥性。

1.3 MTS法檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞增殖的影響接種5×103個細胞每孔至96孔板，培養過夜使細胞貼壁。向對應試驗孔加入不同濃度的Salinomycin，繼續培養24、48、72 h，吸去培養基，加入100 μL含0.5 g·L-1MTS的RPMI 1640，繼續培養4 h。最后用酶標儀測定490 nm波長下的光密度(optical density, OD)值，并計算藥物對細胞的抑制率。抑制率/%=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。以Salinomycin濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖并擬合抑制曲線，并計算IC50值。

1.4 流式細胞術檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞凋亡的影響接種3×105個細胞每孔到6孔板中，Salinomycin處理24、48、72 h。分別收集細胞，按照Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒的說明書要求，先后加入Annexin V和PI，避光、室溫孵育10 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 蛋白提取和Western blot分析收集細胞，經PBS洗滌后用三去污裂解液[50 mmol·L-1Tris-Cl (pH 8.0)，150 mmol·L-1NaCl，0.2 g·L-1疊氮鈉，100 mg·L-1Aprotin，100 mg·L-1PMSF，1 g·L-1SDS，10 g·L-1NP-40，5 g·L-1去氧膽酸鈉]裂解，離心后收集上清，用Bradford法測定蛋白濃度；等量蛋白樣品經10%的SDS-PAGE電泳分離后，轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，P-gp、BAX、BCL-2、caspase-3、caspase-9、α-actin一抗均以1 ∶1 000比例稀釋，4℃孵育過夜。經PBST洗滌后，加入HRP標記的特異性二抗以1 ∶5 000比例稀釋，室溫下孵育2 h，最后用ECL化學發光試劑對X光片顯影，掃描圖片。

1.6 DCFH-DA染色檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞內ROS的影響DCFH-DA可以自由透過細胞膜，被細胞內部的酯酶水解后得到DCFH，不能自由通過細胞膜，從而被裝載到細胞內部。DCFH與活性氧反應后，被氧化生成熒光物質DCF，在485 nm處被激發，發射波長為525 nm，產生的熒光信號通過流式細胞儀檢測。接種3×105個細胞每孔到6孔板中，加入不同濃度Salinomycin處理細胞，12 h后加DCFH-DA探針，37℃下孵育20分鐘，收集細胞，PBS洗滌2 次，重懸浮于400 μL PBS，迅速進行流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

1.7 JC-1染色檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞線粒體膜電位的影響接種3×105個細胞每孔到6孔板中，加入不同濃度Salinomycin處理細胞24 h，PBS 洗滌2次，按試劑盒說明加入1 mL細胞培養液和1 mL JC-1染色工作液混勻， 37℃孵育20 min， JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入培養液，迅速進行流式細胞儀檢測，JC-1單體的最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm；JC-1 聚合物的最大激發波長為585 nm，最大發射波長為590 nm，實驗重復3次。

1.8 統計學方法采用SPSS 15.0軟件One-way analysis of variance方式進行方差分析，兩兩比較采用Student′t檢驗。

2 結果

2.1 Salinomycin抑制乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞的增殖采用8個不同濃度的Salinomycin在3 個不同時間點對MCF-7/DOX細胞進行處理，MTS試驗檢測Salinomycin對細胞增殖抑制的量效和時效關系，結果表明，0、1、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1Salinomycin作用隨著其濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低(Fig 1)。作用24、48、72 h后的IC50分別為(13.27±0.27)、(8.83±0.33)、(3.72±0.15) μmol·L-1。結果說明Salinomycin明顯抑制MCF-7/DOX耐藥細胞增殖，且具有濃度和時間依耐性。

2.2 Salinomycin對乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞多藥耐藥蛋白P-糖蛋白(P-gp)表達和功能的影響采用不同濃度Salinomycin (0、4、8 μmol·L-1)分別處理MCF-7/DOX細胞48 h，Western blot 檢測Salinomycin對P-gp蛋白表達的影響，結果發現，Salinomycin處理對P-gp蛋白的表達沒有明顯影響(Fig 2A)。采用流式細胞儀分析發現，Salinomycin處理并不影響細胞內藥物的濃度(Fig 2B)。進一步采用Salinomycin與P-gp蛋白抑制劑cyclosporine A共處理MCF-7/DOX細胞，以阿霉素作為對照，MTT實驗結果顯示,cyclosporine A能增強阿霉素對MCF-7/DOX耐藥細胞的增值抑制作用，而對Salinomycin的增值抑制效果沒有明顯的影響(Fig 2C)。結果說明Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞的增值抑制作用可能與P-gp蛋白無關。

2.3 Salinomycin誘導乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞凋亡采用Salinomycin (8 μmol·L-1)分別處理MCF-7/DOX細胞24、48、72 h，Annexin V-FITC/PI染色，流式細胞術檢測Salinomycin對MCF-7/DOX耐藥細胞凋亡的影響。結果顯示，隨著時間的增加，MCF-7/DOX細胞的凋亡比率明顯增加，24、48、72 h凋亡比率分別為7.5%、28.2%、46.3% (Fig 3)。

Fig 1 Effects of Salinomycin on cell viability of MCF-7/DOX cells

MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 μmol·L-1) for 24, 48, 72 h; cell viability was determined by MTS assay. The results shown representative of five independent experiments.*P<0.05vscompared to control group.

2.4 Salinomycin對凋亡相關蛋白BAX，Bcl-2，caspase-3和caspase-9表達的影響采用不同濃度Salinomycin(0, 4, 8 μmol·L-1)分別處理MCF-7/DOX細胞48 h，Western blot檢測Salinomycin對凋亡相關蛋白BAX、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表達的影響，結果發現Salinomycin能明顯抑制Bcl-2的表達，而促進BAX、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表達(Fig 4)。

2.5 Salinomycin對乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞ROS、線粒體膜電位的影響為了進一步探究Salinomycin誘導MCF-7/DOX細胞凋亡的機制，采用DCFH-DA熒光探針標記流式細胞儀檢測Salinomycin對細胞內ROS產生的影響。結果顯示，Salinomycin處理明顯增加細胞內DCFH熒光，并呈現濃度依賴性特點(Fig 5A)。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件，通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到細胞膜電位的下降。我們發現Salinomycin處理MCF-7/DOX細胞24 h 后，線粒體膜電位明顯下降( Fig 5B) 。為進一步證實Salinomycin誘導腫瘤細胞凋亡中是否與ROS的產生有關，我們在Salinomycin處理細胞時加入抗氧化劑5 mmol·L-1NAC共處理。結果顯示NAC明顯抑制ROS的產生(Fig 5A)，增加線粒體膜電位(Fig 5B)。NAC處理增加Bcl-2蛋白的表達，抑制BAX、cleaved caspase-3蛋白的表達( Fig 5C)。結果說明ROS的積累在Salinomycin誘導腫瘤細胞凋亡中起著關鍵的作用。

Fig 2 Effects of salinomycin on protein expression and function of P-gp in MCF-7/DOX cells

A: MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (0, 4, 8 μmol·L-1) for 48 h; the protein expression level of P-gp was determined by Western blot assay. B: MCF-7/DOX cells were co-treated with salinomycin (8 μmol·L-1) and doxorubicin (10 μmol·L-1) for 48 h, and cellular doxorubicin concentration was determined by flow cytometry. C: MCF-7/DOX cells were co-treated with salinomycin (8 μmol·L-1) and cyclosporine A (5 μmol·L-1) or doxorubicin (10 μmol·L-1) and cyclosporine A (5 μmol·L-1) for 48 h, The cell viability was determined by MTS assay. The results shown representative of three independent experiments.*P<0.05vscompared to control group.

Fig 3 Effects of salinomycin on cell apoptosis of MCF-7/DOX cells

MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (8 μmol·L-1) for 24 h, 48 h, 72 h. The cell apoptosis was determined by Annexin V/PI staining. The dual parameter dot plots combining Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) and PI fluorescence showed the viable cell population in the lower left quadrant (Annexin V-/PI-), apoptotic cells in the lower right quadrant (Annexin V+/PI+) and the upper right quadrant (Annexin V+/PI+), and necrotic cells in the upper left quadrant (Annexin V-/PI+). The results shown representative of three independent experiments.

Fig 4 Effects of salinomycin on protein expression of BAX, BCL-2, caspase-3 and caspase-9 of MCF-7/DOX cells

MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (0, 4, 8 μmol·L-1) for 48 h; the protein expression levels of BAX, BCL-2, caspase-3, and caspase-9 were determined by Western blot assay. The results shown representative of three independent experiments.

3 討論

腫瘤耐藥的發生是多因素、多途徑共同作用的結果[9]。最新研究表明腫瘤細胞對凋亡的敏感性是影響化療效果的重要因素之一[10]。細胞凋亡過程受到抑制時可導致腫瘤細胞耐藥的發生，尋找高效低毒的凋亡誘導劑，或者選擇無交叉耐藥的聯合化療方案是逆轉腫瘤耐藥性的重要策略。近年來，Salinomycin的藥理作用越來越受到關注。由于Salinomycin被發現能夠選擇性抑制乳腺癌干細胞，且其效率比臨床常用化療藥物紫杉醇高出100多倍[4]。一項最新臨床研究發現，每2 d靜脈給藥200～250 μg·kg-1Salinomycin能有效抑制乳腺癌、頭頸癌轉移，且無明顯的毒副作用[11]。因此Salinomycin被認為是一類潛在的抗癌藥物[12]。

本實驗首次觀察了Salinomycin對乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞增殖的影響，結果發現，Salinomycin能有效抑制乳腺癌耐藥細胞的增殖。腫瘤細胞增加藥物的外排，減少藥物的吸收是其耐受化療藥物的一種主要手段。已知乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞高表達多藥耐藥蛋白P-gp，抑制P-gp蛋白的表達能夠增加MCF-7/DOX耐藥細胞的化療敏感性[13]。Fuchs 等[8]研究發現，Salinomycin可以抑制P-gp蛋白高表達的白血病細胞增殖。我們發現雖然Salinomycin同樣抑制MCF-7/DOX的增殖，卻對P-gp蛋白的表達沒有影響，提示Salinomycin可以克服P-gp蛋白引起的促增殖作用，其機制與P-gp蛋白表達無關。

腫瘤細胞凋亡抵抗是腫瘤化療耐藥的另一重要原因[14]，研究發現Salinomycin可以克服多種凋亡抵抗促進多種腫瘤細胞凋亡[15]。我們發現Salinomycin同樣能夠有效誘導乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞凋亡，且具有時間依賴性。文獻報道[16]，

Fig 5 Effects of salinomycin on ROS production and mitochondrial membrane potential in MCF-7/DOX cells

A: MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (0, 4, 8 μmol·L-1) for 12 h, cellular ROS level was determined by DCFH-DA staining; B: MCF-7/DOX cells were treated with salinomycin (0, 4, 8 μmol·L-1) for 24 h, mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 was used to determine the effects of salinomycin on the change of mitochondrial membrane potential. C: MCF-7/DOX cells were co-treated with salinomycin (8 μmol·L-1) and NAC (5 mmol·L-1) for 48 h, The protein expression levels of BAX, BCL-2, and caspase-3 were determined by Western blot assay. The results shown representative of three independent experiments.

Salinomycin可以通過誘導氧化應激反應來抑制前列腺癌腫瘤細胞增殖而且不影響正常前列腺上皮細胞。Kim等同樣發現Salinomycin能夠引起腫瘤細胞氧化應激反應以及線粒體膜去極化導致細胞凋亡[7]。證據表明氧化應激適應與腫瘤細胞耐藥性具有相似的機制[17]，一些抗氧化蛋白(如PrxII、CAT等)的表達與乳腺癌、膠質瘤、頭頸癌等腫瘤細胞耐藥性成正相關[18]。Diehn等[19]發現乳腺癌干細胞含有較低的ROS水平，而增加細胞內ROS水平能增加乳腺癌干細胞對放、化療的敏感性[20]。我們發現Salinomycin處理：(1)明顯增加乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞內ROS的水平；(2)降低細胞線粒體膜電位；(3)下調凋亡抑制蛋白BCL-2的表達，上調促凋亡蛋白BAX的表達；(4)激活caspase-9、caspase-3蛋白。相反，抗氧化劑預處理則能夠逆轉Salinomycin的作用。結果說明Salinomycin可通過促進ROS產生，激活線粒體凋亡途徑而誘導乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞的凋亡。

總之，本實驗首次發現Salinomycin對乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細胞具有很好的增殖抑制效果，其作用機制可能與誘導ROS產生導致的細胞凋亡有關。那么Salinomycin誘導ROS產生的機制，以及Salinomycin是否在體內同樣具有逆轉乳腺癌耐藥的作用，還需要進一步通過實驗深入研究，以期為臨床聯合應用化療藥物逆轉乳腺癌耐藥提供實驗基礎和聯合用藥策略。

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Anti-proliferative effect of salinomycin on doxorubicin- resistant human breast cancer MCF-7/DOX cells

LIU Hao, LU Min-ying, HE Zhi-min

(CancerResearchInstituteandCancerHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095,China)

Aim To investigate the anti-proliferative effect of salinomycin on doxorubicin-resistant human breast cancer MCF-7/DOX cells. Methods MCF-7 and MCF-7/DOX cells were treated or untreated with salinomycin. Cell viability was detected by MTS assay. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI assay. Reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA staining. Mitochondrial membrane potential was measured by JC-1 assay. The expression of apoptosis related proteins BAX, BCL-2, caspase-3, and caspase-9 were evaluated by Western blot analysis. Results The cell viability was significantly reduced by salinomycin treatment in a dose-dependent manner. The flow cytometry results showed that salinomycin induced MCF-7/DOX cell apoptosis, increased ROS production, and decreased mitochondrial membrane potential. Furthermore, salinomycin decreased the expression of BCL-2, and increased the expression of BAX, cleaved caspase-3, and cleaved caspase-9. Moreover, the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) markedly blocked the above effects. Conclusions Our results suggest that salinomycin-induced apoptosis in MCF-7/DOX is associated with induction of ROS production, and activation of mitochondria apoptosis pathway, which may become a potential chemotherapeutic agent for the therapy of doxorubicin resistant breast cancer.

breast cancer; salinomycin; doxorubicin resistance; cell apoptosis; ROS; mitochondrial membrane potential

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.003.html

2014-10-31,

2015-01-04

國家自然科學基金資助項目(No 81402497)

劉 浩(1981-)，男，博士，助理研究員，研究方向：腫瘤轉移、耐藥的分子機制，Tel：020-66673666，E-mail：haoliu2020@ 163.com； 賀智敏(1957-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：惡性腫瘤發病和治療耐受的分子機制，通訊作者，Tel: 020-66673666，E-mail：hezhimin2005@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.022

A

1001-1978(2015)04-0549-06

R329.24；R329.25；R737.902.2；R979.1；R979.14