大腸桿菌otsA基因的克隆和轉化本生煙草

陸玉建, 張韓杰, 劉南南

(1.濱州學院生命科學系/山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心,山東濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州 256600）

大腸桿菌otsA基因的克隆和轉化本生煙草

陸玉建1,2, 張韓杰1, 劉南南1

(1.濱州學院生命科學系/山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心,山東濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州 256600）

海藻糖是一類重要的滲透調節劑,可以提高植物抵抗多種非生物脅迫的能力。6-磷酸海藻糖合成酶(TPS）是海藻糖生物合成的關鍵酶,在大腸桿菌中,otsA基因編碼TPS。本試驗通過PCR技術克隆otsA基因,構建p2300-otsA-GFP表達載體,用農桿菌介導的方法將otsA基因導入到本生煙草中。對篩選獲得的轉基因植株進行檢測表明,otsA基因已成功整合到本生煙草的基因組中,并能進行有效轉錄。而且研究發現,轉基因幼苗在含有150 mmol/L NaCl的培養基中能夠生長,具有一定的抗鹽脅迫能力。

海藻糖；大腸桿菌；otsA基因；本生煙草；根癌農桿菌

環境脅迫是影響植物生長發育的主要因素,其中又以干旱和鹽脅迫對植物的影響最為嚴重[1-3]。土壤中鹽分過高,會降低植物的滲透勢,導致植物失水,此外,過多的鹽分還可對植物產生離子毒害作用,造成細胞膜損傷,膜透性增強,酶活性降低,葉綠體降解,呼吸作用受阻,氣孔關閉,光合作用受到抑制等,最終導致植物正常的生長發育受阻[1,4]。植物為了消除鹽脅迫所造成的傷害,除了將鹽積累到液泡或排出細胞外,還可以通過在細胞中積累一些小分子有機化合物來維持細胞質的高滲透壓,從而有利于植物在高鹽條件下對水分的吸收[1-2,5]。海藻糖就是其中一類重要的滲透調節劑,廣泛存在于生物界,是一種由2分子葡萄糖縮合而成的非還原性雙糖[6]。在非生物脅迫的條件下,海藻糖可以避免細胞失水而損失養分,保護細胞免受自由基的傷害,還可增加膜脂的流動性和酶的穩定性[1,7-10]。在細菌和酵母中,海藻糖的合成包括2個過程：首先, UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在6-磷酸海藻糖合成酶(TPS）的催化下形成6-磷酸海藻糖；然后,6-磷酸海藻糖在6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP）的作用下轉變為海藻糖[10-12]。在大腸桿菌中,otsA和otsB基因分別編碼TPS和TPP,在逆境脅迫下,海藻糖合成相關酶類能顯著提高細胞中海藻糖的含量,從而增強大腸桿菌適應不良環境的能力[11,13]。在水稻中,大腸桿菌otsA-otsB融合基因過表達可明顯提高水稻抗脅迫能力[10,13]。在擬南芥中,AtTPS1插入突變將使胚胎發育受到抑制,tps1突變體胚胎的細胞壁變厚,細胞分裂明顯減少；而AtTPS1過表達則可增強擬南芥的耐旱能力[14-15]。

海藻糖與生物抗逆能力之間具有密切的關系,但海藻糖在植物細胞中含量很低[11,14],其作用的相關機制還不十分清楚,因此有必要進行深入的研究。本試驗擬通過根癌農桿菌介導的葉盤法將克隆的大腸桿菌otsA導入到本生煙草中,從而初步建立起本生煙草遺傳轉化體系,并篩選出具有一定抗脅迫能力的轉基因植株,以期為今后通過基因工程手段增強植物的耐鹽能力提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為本生煙草(Nicotiana benthamiana）種子,由本實驗室保存。

1.1.2 菌株和質粒 大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens）GV3103由本實驗室保存,p2300-GFP質粒由蘭州大學細胞研究所提供, pTZ57R/T載體購自蘭州鵬程生物技術有限公司。

1.1.3 常用試劑及酶類Taq酶、T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自蘭州鵬程生物技術有限公司,限制性內切核酸酶和Primer STARTMHS DNA ploymerase購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 培養基和培養條件 試驗各階段所用的最佳培養基組成見表1,各培養基中均含3%蔗糖和0.8%瓊脂,pH為5.8,培養條件：每天16 h光照、8 h黑暗,濕度約80%,溫度25℃左右,光照度為2 000 lx[16]。

表1 本生煙草遺傳轉化所用培養基的組成及編號Table 1 The composition and coding of the media for Nicotiana benthamiana

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌otsA基因的克隆 根據NCBI數據庫提供的otsA基因(Accession：X69160）序列設計引物otsA-F：5′-GAGGAGCTCATGAGTCGTTTAGTCGTAGT-3′(下劃線為SacⅠ酶切位點）和otsA-R：5′-ATAGGTACCCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點）,用于克隆otsA基因完整的CDS序列,所用引物由大連寶生物工程有限公司進行合成。以大腸桿菌基因組DNA為模板,高保真PCR擴增otsA,將回收產物連入pTZ57R/T載體(圖1A）。轉化大腸桿菌DH5α,并對重組克隆進行PCR和酶切鑒定。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,60℃復性30 s,72℃延伸1 min 30 s, 35個循環；最后72℃再延伸10 min。將含有目的基因的陽性克隆進行測序(由上海生工生物工程有限公司完成）。

1.2.2 植物表達載體的構建 用限制性核酸內切酶SacⅠ-KpnⅠ分別酶切質粒p2300-GFP和pTZ57R/T-otsA,回收目的片段,用T4 DNA連接酶進行連接,從而構建p2300-otsA-GFP載體(圖1B）。將含目的基因的p2300-otsA-GFP質粒轉入農桿菌GV3101中。

圖1 大腸桿菌otsA基因表達載體的構建Fig.1 Construction of otsA expression vectors

1.2.3 農桿菌介導本生煙草的遺傳轉化 將含有p2300-otsA-GFP質粒的農桿菌接種于LB液體培養基中進行培養,待其OD600約為0.5時離心,加入等體積的Y1培養基懸浮菌體；切取本生煙草的葉片,置于菌液中侵染3～5 min；然后接種到Y2培養基中,共培養2 d；將葉片轉入到Y3培養基中選擇培養,誘導葉片分化,產生不定芽；轉移至Y4中進行增殖培養,切取生長良好的不定芽,在Y5中誘導生根；獲得轉基因試管苗,馴化移栽,篩選鑒定。

1.2.4 轉基因植株的分子檢測 用CTAB法提取野生型和轉化植株葉片DNA,PCR檢測大腸桿菌otsA整合到本生煙草染色體上的情況；Trizol法提取野生型和轉化植株的總RNA,RT-PCR檢測大腸桿菌otsA在轉基因植株中的轉錄水平。

2 結果

2.1 大腸桿菌otsA基因編碼產物的保守結構域分析

大腸桿菌otsA基因全長1 425 bp,其編碼的蛋白由474個氨基酸構成,預測其分子量大小約54 000。利用NCBI數據庫中Conserved Domain Search工具對otsA蛋白的結構進行分析表明(圖2）,在該蛋白的內部存在1個GT1_TPS保守結構域。該結構域是糖基轉移酶GTB類家族(Glycosyltransferase_GTB_type）的成員,由460個氨基酸組成,屬于TPS的催化結構域,參與6-磷酸葡萄糖形成6-磷酸海藻糖的催化過程。

圖2 大腸桿菌otsA基因編碼蛋白保守結構域分析Fig.2 The analysis of conserved domain of otsA encoded protein

2.2 大腸桿菌otsA蛋白序列比對與保守性分析

在逆境脅迫下,otsA能顯著提高大腸桿菌細胞中海藻糖的含量,從而增強其適應不良環境的能力；在酵母和擬南芥中,海藻糖合成的關鍵酶分別為ScTPS1和AtTPS1,它們分別由495和942個氨基酸組成。運用clustalW軟件對otsA、ScTPS1和AtTPS1蛋白的全長氨基酸序列進行比對[17],結果顯示(圖3）,otsA和ScTPS1一致的氨基酸有158個,相似的氨基酸有70個,序列相似性為45.1%；otsA和At-TPS1一致的氨基酸有167個,相似的氨基酸有81個,序列相似性為26.2%；ScTPS1和AtTPS1一致的氨基酸有243個,相似的氨基酸有68個,序列相似性為32.8%。通過分析比對結果發現,otsA和ScTPS1存在較高的相似性,而與AtTPS1存在一定的差異,但它們一致或相似的氨基酸數量較多,因此,可以推測,這三種蛋白至少在部分功能上應該是相似的。

圖3 大腸桿菌otsA、ScTPS1和AtTPS1蛋白全長氨基酸序列比對結果(其中AtTPS1 C端部分氨基酸序列沒有顯示）Fig.3 Sequence alignment between proteins otsA,ScTPS1 and AtTPS1(C-terminal amino acid sequence of AtTPS1 were not shown）

2.3 大腸桿菌otsA蛋白系統進化分析

用clustalW軟件對大腸桿菌和其他12種生物的TPS氨基酸序列進行比對,通過MEGA軟件進行系統進化分析。結果顯示(圖4）,在所構建的系統進化樹中,大腸桿菌和果蠅聚類在一起,表明它們之間有更近的親緣關系和更相似的蛋白質序列特征。大腸桿菌、啤酒酵母和擬南芥處于不同的進化分支,但大腸桿菌與啤酒酵母之間的距離較近,而與擬南芥之間的距離較遠,所以可以推測,大腸桿菌otsA的功能很可能與酵母相似,但與擬南芥中的TPS存在較大的差異。

2.4 大腸桿菌otsA的克隆與表達載體的構建

以大腸桿菌DH5α基因組DNA為模板,PCR擴增otsA基因。將回收的PCR克隆片段與pTZ57R/T載體進行連接,轉化大腸桿菌,提質粒,PCR和酶切鑒定。試驗結果顯示,質粒PCR和雙酶切都可得到大小介于1 200～2 000 bp的條帶,表明目的片段已連入pTZ57R/T(圖5A和圖5B）。對pTZ57R/T-otsA和p2300-GFP質粒進行酶切,將回收的目的片段進行連接。PCR和酶切鑒定重組質粒,結果表明,目的片段已連入p2300-GFP,從而實現p2300-otsAGFP表達載體的構建(圖5C和圖5D）。將p2300-otsA-GFP質粒轉入根癌農桿菌中。

2.5 本生煙草遺傳轉化體系的建立

圖4 基于不同生物海藻糖合成酶氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the biological amino acid sequences of the trehalose synthesis enzymes

圖5 載體的構建與鑒定Fig.5 Construction and identification of the vectors

活化含目的基因的根癌農桿菌,葉盤法轉化本生煙草。將葉片浸入農桿菌液中,然后取出接入不定芽誘導培養基中(圖6 A）。將共培養2 d的外植體接種到篩選培養基中進行不定芽的誘導。經過20 d的培養,可以觀察到本生煙草卷曲的葉片上面分布著大量的芽點(圖6B）。到了第35 d,葉片上產生大量明顯的不定芽(圖6C）。選擇生長情況較好的抗性芽,切取后轉入生根培養基中進行生根培養。6周后,不定芽基部已產生大量的根,試管苗生長健壯(圖6D）。當根布滿培養基底部,幼苗高8～10 cm時,便可進行馴化和移栽。圖6E顯示的是培養室中生長2周的轉基因本生煙草。對篩選出的轉基因植株進行PCR檢測,結果表明,大腸桿菌otsA基因已成功的整合到本生煙草的基因組中(圖6G）。RT-PCR檢測大腸桿菌otsA基因表達情況,顯示該基因在本生煙草中可以有效的進行轉錄(圖6H）。將生長2周的野生型和轉基因幼苗轉移到含150 mmol/L NaCl培養基,1周后發現,野生型幼苗葉片變黃,生長受到強烈的抑制；而轉基因幼苗則對NaCl具有明顯抗性(圖6F）。

圖6 本生煙草的遺傳轉化與鑒定Fig.6 Genetic transformation and identification of Nicotiana benthamiana

3 討論

海藻糖是一種重要的滲透調節劑,可以使生物具有抗環境脅迫的能力[1,6]。在惡劣環境下,低等生物中海藻糖含量較豐富,但是在植物中含量卻很少[11,15]。TPS是海藻糖生物合成的關鍵酶,在大腸桿菌中,otsA基因編碼TPS[9,12-13]。通過利用Conserved Domain Search工具對otsA蛋白保守結構進行分析顯示,在該蛋白的內部存在一個GT1_TPS保守結構域,這與otsA的功能一致。序列比對結果表明,otsA和ScTPS1分享45.1%的相似性,而與At-TPS1序列相似性只有26.2%；系統進化分析發現,大腸桿菌、啤酒酵母和擬南芥處于不同的進化分支,但大腸桿菌與啤酒酵母之間的距離較近,而與擬南芥之間的距離較遠,所以可以推測,otsA的功能很可能與酵母相似,而與擬南芥存在較大的差異,但它們在保守區域存在一致或相似的氨基酸序列,因此,這三種蛋白至少在部分功能上應該是相似的。根據生物信息學分析的結果可以預測,在植物中異源表達otsA基因有可能像在大腸桿菌中一樣,能夠增強其抗脅迫能力。

本試驗克隆了大腸桿菌的otsA基因,并構建了p2300-otsA-GFP表達載體。為了研究大腸桿菌6-磷酸海藻糖合成酶對提高植物抗逆性的作用,通過農桿菌介導的方法將otsA導入到本生煙草中。對篩選得到的抗性植株進行檢測表明,otsA已整合到本生煙草的基因組中并能進行有效的轉錄。此外,與野生型相比,轉基因幼苗耐鹽能力明顯提高。本試驗成功的建立起本生煙草的轉化體系,對于今后通過基因工程技術提高植物抵抗多種非生物脅迫的能力,促進糧食增產以及培育出更優良的農作物都具有非常重要的意義。

[1] 林棲鳳.耐鹽植物研究[M].北京：科學出版社,2004.

[2] 劉國花.植物抗旱耐鹽機制概述[J].安徽農業科學,2008,36 (17）：7084-7085,7092.

[3] 張 科,田長彥,李春儉.一年生鹽生植物耐鹽機制研究進展[J].植物生態學報,2009,33(6）：1220-1231.

[4] 李婭娜,江可珍,別之龍.植物鹽脅迫及耐鹽機制研究進展[J].黑龍江農業科學,2009(3）：153-155.

[5] ZHU J K.Salt and drought stress signal transduction in plants [J].Annu Rev Plant Biol,2002,53：247-273.

[6] 傅琳琳,傅開科.海藻糖的研究現狀及其應用前景[J].江西科學,2000,18(3）：182-186.

[7] 孫蘭菊,岳國峰,王金霞,等.植物耐鹽機制的研究進展[J].海洋科學,2001,25(4）：28-31.

[8] CROWE J H,HOEKSTRA F A,CROWE L M.Anhydrobiosis [J].Annu Rev Physiol,1992,54：579-599.

[9] FILLINGER S,CHAVEROCHE M K,VAN DIJCK P,et al.Trehalose is required for the acquisition of tolerance to a variety of stresses in the filamentous fungusAspergillus nidulans[J].Microbiology,2001,147：1851-1862.

[10]GARG A K,KIM J K,OWENS T G,et al.Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses[J].Proc Natl Acad Sci,2002,99(25）：15898-15903.

[11]GODDIJN,O J M,VAN DUN K.Trehalose metabolism in plants [J].Trends Plant Sci,1999,4：315-319.

[12]AVONCE N,MENDOZA-VARGAS A,MORETT E,et al.Insights on the evolution of trehalose biosynthesis[J].BMC Evol Biol,2006,6：109

[13]KAASEN I,FALKENBERG P,STYRVOLD O B,et al.Molecular cloning and physical mapping of theotsBAgenes,which encode the osmoregulatory trehalose pathway ofEscherichia coli：evidence that transcription is activated by KatF(AppR）[J].J Bacteriol, 1992,174：889-898.

[14]EASTMOND P J,GRAHAM I A.Trehalose metabolism：a regulatory role for trehalose-6-phosphate[J].Curr Opin Plant Biol, 2003,6：231-235.

[15]AVONCE N,LEYMAN B,MASCORRO-GALLARDO J O.TheArabidopsistrehalose-6-P synthaseAtTPS1 gene is a regulator of glucose,abscisic acid,and stress signaling[J].Plant Physiol, 2004,136：3649-3659.

[16]陸玉建,劉俊華,王書平,等.本生煙草愈傷組織的誘導和再生體系的建立[J].江蘇農業科學,2014,42(1）：52-54.

[17]陸玉建,劉 恒,李玉璽,等.AtZW10蛋白亞細胞定位的初步研究[J].植物研究,2013,33(2）：174-180.

(責任編輯：陳海霞）

Cloning of otsA gene in Escherichia coli and its transformation into Nicotiana benthamiana

LU Yu-jian1,2, ZHANG Han-jie1, LIU Nan-nan1

(1.Department of Life Sciences,Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application in Yellow River Delta,Binzhou 256603,China；2.Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy of Shandong Province,Binzhou 256600,China）

Trehalose,as an important osmotic regulator,improves plant tolerance to multiple abiotic stress.InEscherichia coli,TPSis a key enzyme for the biosynthesis of trehalose encoded byotsAgene.In this experiment,otsAgene was cloned and transferred into the genome ofNicotiana benthamianabyAgrobacterium-mediated method.The transgenic seedlings in the medium containing 150 mmol/L NaCl grew much better than wild-type seedlings,indicative of the salt tolerance ofotsA-transgenic seedlings.

trehalose；Escherichia coli；otsAgene；Nicotiana benthamiana；Agrobacterium tumefaciens

Q 785；S572

A

1000-4440(2015）01-0032-07

陸玉建,張韓杰,劉南南.大腸桿菌otsA基因的克隆和轉化本生煙草[J].江蘇農業學報,2015,31(1）：32-38.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.005

2014-06-30

山東省自然科學基金項目(ZR2012CL14）；濱州學院博士基金項目(2010Y08）

陸玉建(1979-）,男,河南南陽人,博士,講師,主要從事細胞工程及分子生物學研究。(Tel）0543-3190096；(E-mail） luyujian79@163.com