植物NRT2家族的分子進化

錢 瑜, 察倩倩, 孔 敏, 劉照坤, 李 英, 侯喜林, 劉同坤

(1.南京農業大學園藝學院/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室,江蘇南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095；3.蘇州市蔬菜研究所,江蘇蘇州 215008）

植物NRT2家族的分子進化

錢 瑜1, 察倩倩2, 孔 敏1, 劉照坤3, 李 英1, 侯喜林1, 劉同坤1

(1.南京農業大學園藝學院/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室,江蘇南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095；3.蘇州市蔬菜研究所,江蘇蘇州 215008）

為了研究硝酸鹽轉運子NRT2家族在植物中的進化關系,綜合利用共線性信息和序列相似性信息,從8種已經進行過全基因組測序的物種(大白菜、大豆、楊樹、葡萄、玉米、水稻、高粱、二穗短柄草）中,搜索擬南芥NRT2的同源基因。通過分析發現,這些基因序列基本都具有MFS超家族的NNP家族基因的典型特征。但單、雙子葉植物之間,NRT2的基因結構存在著較大的差異。系統發育重建結果表明,NRT2基因家族的成員主要是在單、雙子葉植物分歧后進化產生的；同時,不同植物的NRT2基因又具有不同的進化模式。大白菜NRT2家族經歷了基因組三倍化事件及基因片段丟失。因此,擬南芥和大白菜的NRT2家族有較為密切的進化關系,進化分析為利用已有的擬南芥NRT2研究結果進一步在大白菜中開展NRT2的功能研究提供了參考線索。

NRT2；共線性；序列分析；進化

植物氮利用率(Nitrogen use efficiency,NUE）是由植物需求和植物對氮的吸收效率決定的。氮供給影響植株葉片的膨脹率和大小,并且影響植株的總葉片數[1],這些都會影響植物對光照的吸收能力,從而影響植物生產力,對葉菜類作物而言,更是如此。硝酸鹽(）是大多數植物最主要的氮源。為了提高利用率,必須對從土壤到植物和在植物內轉運有更為完整的認知。提高吸收能力和植物氮利用率的重要一步就是要先鑒定負責轉運的轉運子的特征,之后通過傳統育種或者基因工程操作來提高吸收特性。

NRT2家族是高親和硝酸鹽轉運子,包括誘導型和組成型表達的成員[2]。最具有代表性的成員是AtNRT2.1和AtNRT2.2,它們在1號染色體上位于相鄰的位置,并且似乎編碼類似功能的蛋白質[3]。AtNRT2.1對的流入似乎更為重要,并且在根的皮層和表皮中表達[4]。然而,AtNRT2.1和AtNRT2.2二者都可以由供給到缺乏的植株中誘導[5],并且二者是相互補償的,當其中一個表達下降時,另一個的表達就上升[3]。AtNRT2.3在根部和嫩葉(主要是嫩葉）中的表達呈周期性的上升下降[5-6]。AtNRT2.4主要在根部表達,當暴露于環境中時表達量下降[5-6],其在側根的表皮和靠近嫩葉的韌皮部內表達,在根部吸收和韌皮部運輸中均起重要的轉運作用[7]。AtNRT2.5在根部和嫩葉(主要是根部）中表達,并且其表達受到供給的抑制[5-6]。當植株處于環境中時,AtNRT2.6在根部和嫩葉(主要是根部）中的相對表達沒有改變[5-6]。AtNRT2.7主要在種子中表達,具有貯藏的作用[4]。

本研究的目的是認識單、雙子葉植物間硝酸鹽轉運子的區別,并為通過已知功能的模式植物基因來研究其他物種的基因功能提供理論基礎和研究方向。

1 材料與方法

1.1 序列的獲得

選擇擬南芥[7]、大白菜[8]、大豆[9]、葡萄[10]、楊樹[11]、水稻[12]、玉米[13]、高粱[14]、二穗短柄草[15]等9種已經完成全基因組測序的物種(表1）,分析NRT2基因家族的進化。使用已經測序的基因組是為了確保完整性,也可為以后利用已知信息在其他物種中研究硝酸鹽轉運子提供有益的探索。

以擬南芥(Arabidopsis thaliana）NRT2家族基因AtNRT2.1(AT1G08090）、AtNRT2.2(AT1G08100）、At-NRT2.3(AT5G60780）、AtNRT2.4(AT5G60770）、At-NRT2.5(AT1G12940）、AtNRT2.6(AT3G45060）、At-NRT2.7(AT5G14570）為基礎,利用植物基因組復制數據庫(Plant genome duplication database,PGDD；http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication）,通過共線性搜索從大白菜(Brassica rapa）、大豆(Glycine max）、楊樹(Populus trichocarpa）、葡萄(Vitis vinifera）基因組中獲得共線性同源序列。以玉米(Zea mays）NRT2家族基因ZmNRT2.1(GRMZM2G010280）、ZmNRT2.3(GRMZM2G163866）、ZmNRT2.5(GRMZM2G455124）為基礎,利用PGDD,通過共線性搜索從二穗短柄草(Brachypodium distachyon；）、水稻(Oryza sativa）、高粱(Sorghum bicolor）基因組中獲得共線性同源序列。最后,使用BLASTP工具補充未被共線性搜索發現的同源序列。

1.2 共線性分析

基因共線性(Synteny or colinearity）是指染色體通過基因復制或者物種分化分開后,原先在該祖先染色體上的基因仍舊保留在該染色體上,或者原先在該染色體上的基因分散到其他染色體上,但是基因仍處于相對穩定的位置。基因共線性分析參考了Phytozome(http：//www.phytozome.net）和PGDD給出的相關基因的信息,將獲得的信息利用Cytoscape (Version 2.8.2）作圖。

1.3 進化樹分析

進化樹重建使用基因的氨基酸序列。從Phytozome(http：//www.phytozome.net）下載序列,將獲得的核苷酸序列輸入MEGA5(Molecular evolutionary genetics analysis）中,將序列進行翻譯、比對,人工調整明顯不合理的比對,刪除比對較差的氨基酸殘基。將剩下的序列構建系統進化樹進行分析。推斷進化關系使用的是Neighbor-Joining法[16],最優進化樹的分支長度總和為4.39699594,進化樹分支長度的標尺與用來指示系統樹進化距離的單位是一致的。計算進化距離使用的Poisson校正法[17],以每個位點氨基酸替換數為單位。進化樹分析包含了49條氨基酸序列。每個序列對中的所有模糊位點都被去除了,最終的數據集里有667個位點。進化分析在MEGA5中進行[18]。

2 結果與分析

2.1 序列收集結果及分析

為了鑒定NRT2家族同源基因,使用全基因組序列信息進行共線性分析,結果見圖1和圖2。序列收集結果見表2,包含了9個物種的48條序列。在擬南芥中,NRT2家族的7個基因內部間的序列相似度比NRT1家族的要高。利用擬南芥的7條序列,通過共線性分析,在大白菜中發現12條序列,在大豆中發現6條序列,在葡萄中發現5條序列,在楊樹中發現6條序列。利用玉米的3條序列,通過共線性分析,在二穗短柄草中發現3條序列,在水稻中發現3條序列,在高粱中發現3條序列。

利用BLASTP對序列進行了補充,大白菜2條,二穗短柄草4條,玉米1條,水稻1條,高粱2條。將所有的序列通過cDNA和NCBI的CDD數據庫搜索確認,剔除假基因(表2）,還有共計49條序列,進行下一步的分析。

圖1 5種雙子葉植物的NRT2序列共線性分析結果Fig.1 Result of synteny analysis of NRT2 sequence in five dicots species

圖2 4種單子葉植物的NRT2序列共線性分析結果Fig.2 Result of synteny analysis of NRT2 sequence in four monocots species

表2 利用同線性鑒定的9個物種NRT2家族基因序列Table 2 NRT2 family sequences identified by synteny analyses in nine species

NRT2屬于MFS超家族(Major facilitator superfamily）的NNP家族(Nitrate/Nitrite porter family）,其典型特征為具有12個跨膜結構域,在第2和第3個跨膜螺旋結構之間有一個廣泛的MFS序列(G-x-xx-D-x-x-G-x-R）[20],在第5個跨膜螺旋結構上有一個NNP標志序列(G-W/L-G-N-M/A-G）[21]。對篩選后獲得的49條核苷酸序列轉化為氨基酸序列比對后,發現49條序列基本都符合上述特征(圖3）。

對NRT2基因結構的分析結果表明,雙子葉植物的NRT2基因都具有相對復雜的結構,基本都包含有內含子和外顯子,而單子葉植物的NRT2基因基本都不含有內含子(表3）。單、雙子葉植物之間這一明顯的基因結構差異,暗示了NRT2基因家族成員的一次古老的分歧。

2.2 進化樹分析

進化樹(圖4）中,分支a、b、c衍生的基因都包含單、雙子葉植物,因此結點A代表祖先NRT2基因經歷了三倍化復制事件,這正和單、雙子葉分歧前的全基因組三倍化復制事件(γ）對應[10,22-23]。復制產生的3個拷貝各自又經歷了不同的進化模式。

表3 9個物種中獲得的NRT2基因的總結Table 3 Summary of NRT2 genes in nine species

圖3 單、雙子葉植物中NRT氨基酸序列比對結果Fig.3 Multi-alignment of NRT amino acid sequences in monocots and dicots

分支a包含與AtNRT2.1～AtNRT2.4及At-NRT2.6同源的序列,包含了較多的序列。分支a中,單、雙子葉植物經歷分歧后,各自又經歷了差異化的進化過程,表明這些基因主要是在單、雙子葉植物分歧后進化而來的。雙子葉植物AtNRT2.1～At-NRT2.4及AtNRT2.6同源序列都具有較復雜的基因結構,含有多個外顯子,而單子葉植物的同源序列只有1個外顯子,從基因結構角度證明了這種分歧是在單、雙子葉植物分歧后產生的。AtNRT2.1與AtNRT2.2是2個相鄰的反向基因,AtNRT2.3和At-NRT2.4是串聯重復,AtNRT2.6與AtNRT2.3還有高達89%的序列相似度[24]。這些可能與擬南芥進化過程中所經歷的2次全基因組復制事件(β和α）有關。進化關系上較近,表明單子葉植物的AtNRT2.1～AtNRT2.4及AtNRT2.6同源序列可能與AtNRT2.1和AtNRT2.2有類似的功能,但是確認這些功能還需要恰當的功能分析。分支a中基因的外顯子結構模式有1-0、2-1、3-2、4-3這4種模式(圖5）,3-2模式的序列最多。通過細致的序列比對發現,3-2模式序列的第2個外顯子與2-1模式序列的第1個外顯子尾部的序列相似度很高,2-1模式的序列可能是由3-2模式的序列中第1個內含子的丟失進化而來的。同樣,4-3模式序列的第2個外顯子與3-2模式序列的第1個外顯子的尾部序列相似度也很高,4-3模式序列可能是由3-2模式序列中第1個外顯子被撕裂加入了一段內含子序列進化而來的。單子葉植物的序列都是1-0模式,應該是由內含子完全丟失進化而來。

分支b包含與NRT2.5基因同源的序列。每種單子葉植物中都具有NRT2.5同源序列,而雙子葉植物大豆和楊樹中有2個拷貝,表明在進化過程中,一些物種中NRT2.5的功能可能得到了加強。單子葉植物NRT2.5同源序列的結構比較一致,而雙子葉植物的NRT2.5同源序列結構有很大的差異。

分支c包含與NRT2.7基因同源的序列。除玉米外的單子葉植物中都具有NRT2.7同源基因,雙子葉植物中只有大白菜有一個拷貝。這5個NRT2.7同源序列都具有類似的基因結構,都含有2個外顯子。但是多個物種中NRT2.7同源序列的丟失,表明可能在一些物種中,該基因的功能正在丟失。

2.3 大白菜NRT2家族基因的分析

大白菜中共發現NRT2同源序列14條,比擬南芥多7條,其包含了多條串聯重復序列(Bra002451和Bra002453,Bra018655和Bra018656,Bra031610和Bra031611,Bra037625和Bra037626,Bra038301和Bra038302）。這可能與大白菜進化過程中的基因組三倍化事件及三倍化事件中基因片段的丟失密切相關[8]。AtNRT2.1與AtNRT2.2是相鄰的反向基因[25],大白菜中BrNRT2.1A(Bra031610）與BrNRT2.2(Bra031610）有類似的關系。AtNRT2.3和At-NRT2.4是串聯重復,大白菜中BrNRT2.3A(Bra002451）和BrNRT2.4(Bra002453）也是串聯重復。進化樹分析(圖4）發現,大白菜NRT2基因類似序列與擬南芥NRT2基因基本都位于同一分支。這些都表明大白菜與擬南芥有著極密切的進化關系。大白菜NRT2.1類似序列有4條,可分為3支(Bra018655和Bra018656為串聯復制,可能與后期的基因組進化有關）。NRT2.6和NRT2.3同源序列分別有2條,剩余的只有1條。還有2條NRT2-like序列(Bra037626和Bra038301）與AtNRT2.3和At-NRT2.6位于同一大分支,但沒有與它們在同一小分支。通過大白菜基因組測序分析,我們認為其基因組經歷了三倍化事件,而其NRT2.1同源序列的三倍化恰好符合這一觀點。其他序列只有2條,或者只有1條的現象,可能與基因組三倍化過程中基因丟失片段的程度不同有關。2條NRT2-like的出現,首先可能有進化樹的計算方法有關,AtNRT2.1和AtNRT2.6有89%的相似度,可能對周邊序列進化關系的計算產生影響；此外,還可能是由于擬南芥基因組在幾百萬年的進化中,基因組產生了一些缺失而大白菜保留了這部分基因所造成的。

3 討論

對幾種典型的單、雙子葉植物NRT2基因家族的研究結果顯示,在基因結構上單、雙子葉植物之間可能存在著明顯的差異。由于單子葉植物的NRT2基因基本都沒有內含子,這可能是跟隨著單雙子葉植物的分歧而發生的；也有可能是單子葉植物從原始的雙子葉植物分歧后,早期的單子葉植物丟失了NRT2的內含子,而雙子葉植物保留了內含子[23]。然而,深入研究植物中NRT2基因家族的進化模式,仍然需要更多物種的基因組數據。NRT2家族是MFS超家族的一部分,因此,可以對這一超家族中其他的基因家族進行研究,探究它們在的內外顯子結構上是否有類似的現象。擬南芥AtNRT2.7的功能是裝載進入種子中[4],單、雙子葉植物的NRT2.7基因具有非常相似的基因結構,表明在裝載進入種子和胚胎的過程中,單、雙子葉植物之間可能保留了類似的機制。確定植物的NRT2基因之間是否有類似的功能,還是進化分歧導致了功能的變化,仍需要更深入的數據與試驗分析。任何常見的蛋白質修飾或者序列區別的隔離產生的功能上的分歧分開了單、雙子葉的NRT2s,在指導使用生物技術方法,提高植物中轉運能力方面,可提供重要的結構或功能信息。

圖4 NRT2家族的進化關系Fig.4 Phylogenetic relationships of the NRT2 family

圖5 植物NRT2外顯子進化模型Fig.5 Evolution model of NRT2 extron in plant

大白菜NRT2同源序列與擬南芥有著較近的進化關系,表明大白菜中NRT2序列與擬南芥NRT2基因可能具有比較類似的功能。根據擬南芥中大白菜NRT的同源基因,我們對大白菜中14個NRT2的家族成員的表達進行分析,結果發現,9個(Bra031610、Bra018656、Bra018655、Bra030713、Bra031611、Bra037625、Bra038302、Bra037626、Bra038301）屬于誘導型表達,5個(Bra002451、Bra020230、Bra002453、Bra016747、Bra023475）屬于組成型表達。孔敏等[26]研究發現,白菜中擬南芥AtNRT2.1的同源基因BcNRT2受硝酸鹽誘導,這與我們的分析BrNRT2.1A-D屬于誘導型表達相一致,說明我們對大白菜中14個NRT2家族成員的表達分析是可信的。今后,在研究這些基因功能時,可以更為有效地參考與利用擬南芥NRT2基因的研究信息,為大白菜NRT2序列的功能驗證提供相對簡便的途徑。不結球白菜與大白菜是近親,同屬蕪菁的一種,大白菜已完成基因組測序[8],參考其基因組信息,可以為不結球白菜等作物的研究提供參考信息。

對單、雙子葉植物的NRT2基因家族的分析揭示了該基因家族的一些顯著的差異,提出了關于植物中NRT2轉運子的進化和擬南芥作為轉運的模式作物的合適性等一些重要問題。本研究為未來研究植物中硝酸鹽轉運子和轉運提供了一個框架,并且可能為通過NRT基因的遺傳操縱來提高植物氮利用率給出了指導性策略。

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(責任編輯：張震林）

Molecular evolution of NRT2 gene family in plant

QIAN Yu1, CHA Qian-qian2, KONG Min1, LIU Zhao-kun3, LI Ying1, HOU Xi-lin1, LIU Tong-kun1

(1.College of Horticulture/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China；2.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China；3.Suzhou Institute of Vegetable Science,Suzhou 215008,China）

In order to study the evolutionary relationship ofNRT2family of nitrate transporters in plants,synteny analysis approach and sequence similarity were used to identify putative orthologues ofArabidopsis NRT2 genes in other eight fully sequenced genomes(Chinese cabbage,soybean,western poplar,grape vine,maize,rice,sorghum,and purple false brome）.Sequence analysis reveals that these sequences belong to the nitrate/nitrite poter(NNP）family of the major facilitator superfamily(MFS）.However,there is significant difference in theNRT2gene structure between monocots and dicots.Phylogentic tree analysis showed that,most members of theNRT2family developed primarily following the divergence of the monocots and dicots.Simultaneously,the evolution models ofNRT2in different kinds of plants varied.NRT2family of Chinese cabbage(Brassica rapa）generated the genome triplication and gene loss.Therefore,theNRT2family in Chinesecabbagehasarelativelycloseevolutionary relationship with that ofArabidopsis.

NRT2；synteny；sequence analysis；evolution

S601

A

1000-4440(2015）01-0045-10

錢 瑜,察倩倩,孔 敏,等.植物NRT2家族的分子進化[J].江蘇農業學報,2015,31(1）：45-54.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.007

2014-06-27

國家自然科學基金項目(31301782）；江蘇省自然科學基金項目(BK20130673）；中國博士后基金項目(2014M550294）；南京農業大學青年科技創新基金項目(KJ2013015）

錢 瑜(1989-）,女,江蘇蘇州人,碩士研究生,主要從事不結球白菜相關研究。(E-mail）pei_1224@126.com

劉同坤,(Tel）025-84395332；(E-mail）liutk@njau.edu.cn