基于αs-酪蛋白特異性的牛乳總蛋白質ELISA定量檢測方法的建立

張 咪, 高 璐, 印伯星, 蘇萬業,3, 楊振泉,3, 顧瑞霞,3

(1.揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127；2.揚州市康源乳業有限公司,江蘇揚州 225009；3.江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225127）

基于αs-酪蛋白特異性的牛乳總蛋白質ELISA定量檢測方法的建立

張 咪1, 高 璐1, 印伯星2, 蘇萬業1,3, 楊振泉1,3, 顧瑞霞1,3

(1.揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127；2.揚州市康源乳業有限公司,江蘇揚州 225009；3.江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225127）

本研究旨在建立牛乳中總蛋白質的ELISA定量檢測方法,并評價該方法在牛乳摻假辨識中的應用效果。首先用αs-酪蛋白標準品免疫新西蘭白兔,制備αs-酪蛋白特異性抗血清,并建立αs-酪蛋白的間接ELISA檢測方法,結果顯示血清效價為1∶640,αs-酪蛋白檢測的線性范圍是25～600 ng/ml,R2=0.999 5,回收率是96.6%～105.2%。再應用乳成分分析儀,凱氏定氮法和所建立的ELISA法測定8份來源不同的原料乳中總蛋白和αs-酪蛋白含量,結果顯示不同牛乳中總蛋白質含量在0.029 2～0.029 8 g/ml,αs-酪蛋白含量在0.008 4～0.009 2 g/ml,占牛乳總蛋白質的比例恒定,平均為0.3,并用該系數建立牛乳中總蛋白質的定量方法。最后對5份人為兌水稀釋、添加尿素、BSA和三聚氰胺的模擬摻雜牛乳樣品進行檢測,測定結果表明基于αs-酪蛋白的ELISA方法比乳成分分析儀法和凱氏定氮法具有更高的靈敏性和特異性,含氮添加物對測定結果無顯著影響(P＞0.05）,更適合于作為原料乳及含乳產品中牛乳蛋白質的定量分析。

牛乳；αs-酪蛋白；ELISA；總蛋白

隨著生活水平的提高,人們對牛奶及其制品的需求量也日益增加。另一方面,受利益的驅使,在牛奶及其制品中摻雜摻假的事件時有發生。牛乳中的摻假物主要包括小分子含氮物,如尿素、三聚氰胺以及水解的低價非乳蛋白,以彌補牛乳兌水后乳蛋白比重下降。傳統的凱氏定氮檢測方法需要費時的樣品前處理,通過測定牛乳中的總氮含量來反映總蛋白含量,特異性差,不能排除小分子含氮物質以及摻入雜蛋白對測定結果的干擾[1]。乳成分分析儀雖然能夠快捷地分析牛乳中的蛋白含量,但是設備昂貴,而且有研究結果表明當牛乳中摻入蛋白粉和脲時,乳成分分析儀的測定數據也會上升,測定結果會受到一定干擾[2]。因此建立牛乳中蛋白成分特異性的定量測定方法,實現摻假牛乳的快速廉價檢測,對杜絕乳制品摻假現象的發生具有重要意義。

國內已有部分研究報道基于牛乳中αs-酪蛋白的ELISA測定方法,結果顯示該方法是一種廉價、靈敏、特異的方法[3],但目前尚未明確牛乳中αs-酪蛋白含量與總蛋白含量的換算系數,而凱氏定氮法和乳成分分析儀測定法分析的均為總蛋白含量,因此ELISA法測定結果不能與凱氏定氮法和乳成分分析儀測定結果直接進行比較。本研究通過制備αs-酪蛋白的多克隆抗體,建立牛乳中αs-酪蛋白定量檢測方法。通過測定結果與乳成分分析儀和凱氏定氮法測定的總蛋白含量比較分析,獲得牛乳中αs-酪蛋白與總蛋白的換算系數。同時應用這三種方法對模擬的摻假牛乳進行測定,評價了ELISA法的特異性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs-酪蛋白標準品購自日本WAKO公司；新西蘭健康雄性白兔來自揚州大學比較醫學中心；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；HRP標記的羊抗兔IgG、TMB、BSA購自上海生工生物工程有限公司；新鮮原料乳樣品分別來自揚州地區不同的牧場,貯藏于4℃冰箱備用。

1.2 儀器與設備

Bio-Tek Elx-800全自動酶標儀,美國寶特公司生產；UDK159全自動凱氏定氮儀,意大利VELP公司生產；UL80BC型乳成分分析儀,杭州浙大優創科技有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 αs-酪蛋白多克隆抗體的制備 參照文獻[4]制備αs-酪蛋白多克隆抗體。健康新西蘭白兔在新環境下預養一周后進行耳緣靜脈采血,分離血清作為抗血清效價檢測時的陰性對照。αs-酪蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化,腹部皮下多點注射新西蘭白兔,初次免疫劑量為0.2 mg/(kg·bw）；分別于第4周、第5周、第6周進行加強免疫[免疫劑量為0.1 mg/(kg·bw）]；最后一次加強免疫5 d后耳靜脈取血,4℃放置2 h,以3 000 r/min的轉速離心10 min,收集抗血清,-20℃保存。

1.3.2 抗血清效價的測定 參照文獻[5]測定抗血清效價。將αs-酪蛋白標準品稀釋至100 μg/ml進行包被,每孔100 μl,4℃過夜；傾去包被液,每孔加200 μl PBST洗滌3次,每次10 min,甩干后加入100 μl含2.5%BSA的PBS,37℃封閉1 h；傾去封閉液,洗滌3次,每次10 min；將經過10倍稀釋的兔抗血清以每孔100 μl的量加入酶標板倍比稀釋,陰性血清稀釋溶液作為對照,每樣重復3次,37℃溫育1 h,洗滌3次,每次10 min；每孔加入100 μl HRP標記的羊抗兔IgG,37℃保溫1 h；洗滌3次,每次10 min,每孔加入100 μl TMB工作液,37℃避光反應10 min,加入50 μl終止液(2 mol/L H2SO4）后,用酶標儀測定450 nm處吸光值。抗體的效價以抗血清的稀釋度表示,檢測結果以P(血清）/N(陰性血清）≥2.1,P(血清）＞0.2為陽性判斷依據。

1.3.3 ELISA反應條件優化 參照文獻[6]應用方陣滴定法選擇包被抗原和抗體的最佳工作濃度。將αs-酪蛋白標準品進行梯度稀釋后包被,4℃過夜；洗滌3次后,加入10倍稀釋的兔抗血清倍比稀釋,陰性血清做對照,37℃溫育后,洗滌3次；加入酶標抗體；底物顯色后測定OD值。選擇強陽性血清的OD值為0.8左右,陰性血清OD值小于0.1的包被抗原稀釋度為最適工作濃度,此時對應的血清稀釋度為抗體最佳工作濃度。

1.3.4 標準曲線的建立 制備濃度為50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1 000 ng/ml、1 200 ng/ml、1 500 ng/ml、2 000 ng/ml的αs-酪蛋白標準液,各取100 μl包被酶標板,每樣3孔平行,用已知最佳工作濃度的兔血清作為檢測抗體,進行ELISA測定。測定結果以αs-酪蛋白標準品的濃度為橫坐標,吸光度值(OD450）為縱坐標,繪制曲線并尋找線性范圍建立標準曲線回歸方程。應用建立的線性回歸方程計算變異系數(標準偏差/均值）和回收率(測定αs-酪蛋白濃度/制備αs-酪蛋白濃度）,評價穩定性和準確性。

1.3.5 牛乳中αs-酪蛋白的測定 將牛乳樣品進行梯度稀釋后包被96孔酶標板,用已知最佳工作濃度的抗血清作為一抗,HRP-羊抗兔IgG作為二抗,按優化條件(同標準曲線）進行ELISA測定,根據吸光度值(OD450）隨稀釋度變化規律確定線性范圍。取OD450在0.2至0.8之間對應的稀釋度用于計算牛乳樣品中的αs-酪蛋白含量。

1.3.6 牛乳中總蛋白質測定 凱氏定氮法參照國標[7]取5 ml牛乳樣品進行總蛋白質含量測定,乳成分分析儀根據操作說明取20 ml牛乳樣品進行總蛋白質含量測定,每個樣品平行測定3次,取平均數用于分析。ELISA法總蛋白質定量按公式：

式中：X為牛乳中總蛋白質含量,單位為ng/ml；A為450 nm處吸光度；b為標準曲線回歸方程截距；a為標準曲線回歸方程斜率；F是αs-酪蛋白換算為總蛋白質的系數；n為牛乳樣品稀釋倍數。

1.3.7 模擬摻雜牛乳蛋白質定量 取400 ml原料乳,平均分成4份,1份作為空白對照,其余3份分別加入1 g尿素、BSA、三聚氰胺(即含氮物的濃度為10 g/L）。用所建立的ELISA法、凱氏定氮和乳成分分析儀3種方法對樣品總蛋白質含量進行檢測,將測定結果與對照組進行比較,評價測定結果的特異性。

用蒸餾水對原料乳及模擬樣品進行10倍稀釋,應用ELISA法,凱氏定氮和乳成分分析儀3種方法對樣品中總蛋白質含量進行檢測,根據測定結果評價測定方法的靈敏性。

2 結果與分析

2.1 抗血清效價

將經過10倍稀釋的兔抗血清按2n倍比稀釋, ELISA測定反應后的吸光度值,N(陰性血清）均值為0.086,當兔抗血清稀釋26倍時,P(陰性血清）均值為0.362,P＞0.2,P/N≥2.1,所以抗血清效價為1∶640。

2.2 ELISA反應條件優化

αs-酪蛋白標準品初始濃度為100 μg/ml,根據方陣滴定法,當抗原稀釋160倍時,強陽性血清的OD450值為0.833,陰性血清OD450值為0.107,包被抗原的最適工作濃度為625 ng/ml,對應的抗血清最佳稀釋倍數為1∶320。

2.3 ELISA檢測標準曲線測定

應用1∶320的抗血清作為檢測抗體,以質量濃度為0～2 000 ng/ml梯度稀釋的αs-酪蛋白溶液作為包被抗原,測定結果顯示αs-酪蛋白質量濃度為25～600 ng/ml時,OD450值與αs-酪蛋白濃度呈顯著線性相關,繪制標準曲線(圖1）,所得線性回歸方程為Y=0.001 3x+0.025 9,R2=0.999 5。將OD450測定值代入線性方程,計算αs-酪蛋白濃度測定值。結果顯示,回收率為96.6%～105.2%,平行測定值的變異系數為0～4.14%,表明αs-酪蛋白ELISA定量方法具有較好的重復性和準確性。

圖1 αs-酪蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of αs-casein

2.4 牛乳中總蛋白質及αs-酪蛋白的測定結果

通過對8種原料乳樣品進行ELISA測定,結果顯示稀釋度為10 000～12 500時,OD450在0.2～0.8時呈線性變化。選擇12 500作為稀釋參數(n）,根據線性方程計算出原料乳中αs-酪蛋白含量。定量結果與乳成分分析儀測定的總蛋白含量比較分析,結果如表1所示。從表1中可以看出不同原料乳中αs-酪蛋白在總蛋白質含量中所占的比例為0.29～ 0.32,含量相對穩定,平均值為0.30。因此,牛乳中αs-酪蛋白與總蛋白質的換算系數(F）為0.30,計算得出ELISA法總蛋白質定量公式為：X=2 564.1An-66.4n,式中X為牛乳中總蛋白質含量；A為450 nm處吸光度；n為牛乳樣品稀釋倍數。

表1 牛乳中αs-酪蛋白與總蛋白質比例測定Table 1 The determination of the ratio of αs-casein to total protein in the milk

2.5 ELISA定量檢測方法在摻雜牛乳檢測中的應用

2.5.1 模擬摻雜牛乳樣品總蛋白質定量結果 應用所建立的ELISA法,凱氏定氮法和乳成分分析儀測定法對人為摻入尿素、BSA和三聚氰胺的原料乳(含氮物濃度10 g/L）總蛋白質含量進行測定。由表2中可以看出,應用乳成分分析儀,測得對照樣品的總蛋白質含量為0.029 6～0.029 8 g/ml；凱氏定氮法對照樣品的總蛋白質含量結果為0.025 3～0.033 4 g/ml；ELISA法測定對照樣品的總蛋白質含量結果為0.029 0～0.031 0 g/ml。

當原料乳中摻入尿素、BSA、三聚氰胺時,凱氏定氮法測得的總蛋白含量值均顯著上升,其中摻入三聚氰胺對凱氏定氮法檢測結果影響最為顯著,上升值為0.031 8～0.045 1 g/ml,摻入尿素對凱氏定氮法檢測結果影響也較為顯著,上升值為0.026 3～0.028 5 g/ml；乳成分分析儀測得的蛋白含量也有明顯上升,其中摻入尿素對乳成分分析儀分析法結果影響較為明顯,上升值在0.006 4至0.007 6 g/ml之間。本研究所用尿素和三聚氰胺含氮量分別為46.6%、66.6%,說明含氮物質干擾對凱氏定氮法檢測牛乳中蛋白質含量影響最為明顯,且含氮量越高,影響越大。而采用本研究所建立的ELISA法測定的摻入尿素、BSA、三聚氰胺牛乳蛋白質含量,與對照牛乳相比沒有顯著變化,說明牛乳中摻入尿素、BSA、三聚氰胺對ELISA定量檢測乳品中總蛋白含量沒有明顯的影響,與凱氏定氮法和乳成分分析儀的檢測方法相比,ELISA法具有很好的特異性和穩定性。

2.5.2 稀釋牛乳中總蛋白質定量結果 用蒸餾水對原料乳及模擬摻假樣品進行10倍稀釋,應用所建立的ELISA法,凱氏定氮法和乳成分分析儀對樣品中總蛋白質含量進行檢測,測定結果如表3所示。由表3可以看出,當原料乳稀釋10倍后,乳成分分析儀測得的蛋白質含量值0.000 2 g/ml與預計值(未稀釋濃度/稀釋倍數）0.003 0 g/ml相比有顯著變化,而凱氏定氮和所建立的ELISA法測出的牛乳總蛋白質含量均與預計值一致,沒有顯著變化,說明摻水對乳成分分析儀測定結果影響很大；當原料乳稀釋100倍、1 000倍后,乳成分分析儀已無法測出牛乳的總蛋白質含量,而凱氏定氮和所建立的ELISA法仍能對總蛋白質含量進行準確定量,與預計值相比沒有顯著變化,說明這兩種方法在檢測摻水牛乳樣品時比乳成分分析儀測定更為靈敏。

表2 原料乳中模擬摻雜物對三種方法測定的蛋白質含量的影響Table 2 Influence of adulterants on the protein quantification in the raw milk by three methods

模擬摻假樣品稀釋10倍后,應用乳成分分析儀測定的總蛋白質含量與預計值0.003 0 g/ml相比均顯著下降,其中三聚氰胺的影響最大,下降值為0.001 5 g/ml,其次是BSA和尿素；用凱氏定氮測得總蛋白質含量與預計值0.000 3 g/ml均有不同程度的上升,其中摻入尿素和三聚氰胺的模擬稀釋樣品的總蛋白質測定值上升顯著；而用所建立的ELISA法對3份稀釋后的模擬樣品進行總蛋白質定量時,測定值近似于預計值0.002 9 g/ml,表明ELISA法在低濃度下靈敏度依然很強,且特異性不受影響。

表3 原料乳加水稀釋對三種方法測定的蛋白質含量的影響Table 3 Influence of dilution with water on the protein quantification by three methods

3 討論

乳成分分析儀雖然可以方便、快捷地測定牛乳中總蛋白質含量,精密度高,但設備昂貴,而且當牛乳中摻入含氮物質時,測得的蛋白質含量值顯著上升；摻入水時,測得的蛋白質含量值與預計值相比顯著下降,表明摻雜、摻水對乳成分分析儀法測定精確度具有較大影響。

原料乳兌水稀釋后,凱氏定氮法仍能準確測量樣品中總蛋白質含量,表明其靈敏性高,但傳統的凱氏定氮法是通過測定牛乳中總氮元素含量來反映總蛋白質含量,并且需要進行費時的樣品前處理,當原料乳中摻入含氮量高的尿素和三聚氰胺時,凱氏定氮法測得蛋白質含量理論值應分別增加0.029 7 g/ml、0.042 5 g/ml,由于操作過程中摻入的物質未溶解完全,實際測量值比理論值低了4.0%～11.4%、16.1%～25.2%,表明凱氏定氮法特異性差,不能排除小分子含氮物質以及摻入雜蛋白質對測定結果的干擾,與此同時,人為操作對測定結果的影響也很大。

目前研究酪蛋白質含量的測定大多基于酪蛋白質沉淀檢驗方法,由于等電點沉淀測得的是粗酪蛋白質含量,純度不高,不能準確定量,而且不能鑒別大豆分離蛋白粉的摻假行為[8]；毛管電泳技術雖然可以快速分析牛乳中的蛋白質組分,檢測牛乳中添加雜蛋白質的摻假情況[9],但其設備昂貴,操作人員需要一定的訓練,制約了此項技術的普及。

本試驗通過建立牛乳中αs-酪蛋白質定量的線性回歸方程Y=0.001 3x+0.025 9(R2=0.999 5）,并將測得αs-酪蛋白質含量與乳成分分析儀測得的牛乳中總蛋白質含量進行比較,得到牛乳中αs-酪蛋白質與總蛋白質的換算系數(F）為0.30,最終得出基于αs-酪蛋白特異的ELISA法測定牛乳總蛋白質的定量公式：X=2 564.1An-66.4n(式中：X為牛乳中總蛋白質含量；A為450 nm處吸光度,n為牛乳樣品稀釋倍數）。

應用所建立的基于αs-酪蛋白質的ELISA法對不同原料乳、人為摻假牛乳、兌水牛乳和摻假兌水牛乳進行檢測時,表現了較好的穩定性、特異性和靈敏性,因而此法更適合于作為原料乳及含乳產品中牛乳蛋白質的定量分析。在此研究的基礎上,可以進行αs-酪蛋白質快速檢測試劑盒研制,實現摻假牛乳的快速廉價檢測。

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(責任編輯：陳海霞）

Establishment of a quantitative ELISA method for detection of total milk protein based on the specificity of αs-casein

ZHANG Mi1, GAO Lu1, YIN Bo-xing2, SU Wan-ye1,3, YANG Zhen-quan1,3, GU Rui-xia1,3

(1.College of Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China；2.Yangzhou Kangyuan Dairy Ltd,Yangzhou 225009,China；3.Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control,Yangzhou 225127,China）

This study aims to establish a ELISA method to quantify the total protein(TP）in milk and to evaluate its application in identification of the adulterated milk.Here,αs-casein(αs-CN）standard sample was used to immunize New Zealand white rabbits for preparing anti-αs-CN polyclonal antibody(PcAb）.The result showed that the titer of PcAb was 1∶640,and the linear range of the detection of αs-CN was 25～600 ng/ml with correlation coefficient of 0.999 5 and the recovery rate between 96.6%and 105.2%.The contents of αs-CN and TP in milk from 8 different resources ranged from 0.008 4 to 0.009 2 g/ml and from 0.029 2 to 0.029 8 g/ml detected by milk analyzer and kjeldah method.The percentage of αs-CN to TP stayed constant at 0.3,which led to the successful development of αs-CN-based ELISA for detection of TP in milk.The ELISA method showed better sensitivity and specificity than the other two approachesin four milk samples which were diluted with water and artificially added with urea,BSA and melamine,respectively.The content of αs-CN was independent of nitrogen additives.In conclusion,the established ELISA method was suitable for analyzing the TP content in the milk and milk products.

milk；αs-casein；ELISA；total protein

TS252.1

A

1000-4440(2015）01-0087-06

張 咪,高 璐,印伯星,等.基于αs-酪蛋白特異性的牛乳總蛋白質ELISA定量檢測方法的建立[J].江蘇農業學報,2015,31 (1）：87-92.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.013

2014-06-17

國家自然科學基金項目(31371806）；揚州市科技攻關項目(yz2011090）；江蘇省青藍工程資助項目

張 咪(1990-）,女,江蘇宜興人,碩士研究生,研究方向為食品微生物應用與控制研究。(E-mail）zhangmi900911@ sina.com

楊振泉,(E-mail）yangzq@yzu.eud.cn