硫化物醌氧化還原酶定向表達載體的構建及細胞轉染表達檢測

于建寧, 楊燕燕, 于峰祥, 時小艷, 徐小波, 王公金

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014；2.青島市植物園管理處,山東青島 266071；3.南京農業大學動物科技學院,江蘇南京 210095；4.江蘇食品職業技術學院醫藥與健康管理系,江蘇淮安 223003）

硫化物醌氧化還原酶定向表達載體的構建及細胞轉染表達檢測

于建寧1, 楊燕燕2, 于峰祥3, 時小艷4, 徐小波1, 王公金1

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014；2.青島市植物園管理處,山東青島 266071；3.南京農業大學動物科技學院,江蘇南京 210095；4.江蘇食品職業技術學院醫藥與健康管理系,江蘇淮安 223003）

為建立硫化物醌氧化還原酶(SQR）的腸道定向表達載體,同時通過轉染小鼠腸道上皮細胞確定載體的有效性,本試驗采用重疊PCR、中間載體法、酶切連接法獲得重組載體,通過脂質體轉染法將重組載體轉入小鼠腸道上皮細胞,并鑒定重組載體的特異性表達。結果顯示,成功構建了以腸脂肪酸結合蛋白質(IFABP）為啟動子的SQR腸道定向表達載體pcDNA3.1(-）-IFABP-SQR-GFP,并在小鼠腸道上皮細胞中檢測到表達的融合綠色熒光蛋白質(GFP）。表明IFABP啟動子能夠在腸道細胞中定向啟動SQR的表達。

硫化物醌氧化還原酶；定向表達載體；腸脂肪酸結合蛋白質；腸上皮細胞

環境友好型養殖業是畜牧業可持續健康發展的新方向。改革開放以來,隨著中國國民經濟的全面、快速發展,人民生活水平的不斷提高,中國畜牧業取得了空前的發展。然而,隨著畜牧場規模化、集約化和機械化程度的提高,畜禽糞便已成為一個不可忽視的污染源。畜禽糞便不僅會帶來水體和土壤污染,也會帶來嚴重的空氣污染。據檢測,一個年出欄1×105頭的養豬場,1 h可向大氣排出近148.0 kg氨氣(NH3）、13.5 kg硫化氫(H2S）、24.0 kg粉塵和1.4×109個菌體,這些物質的污染半徑可達5 km,而塵埃和病原微生物可隨風傳播30 km以上[1-2]。如何降低這些廢氣排放一直是困擾大型養豬場的難題之一。目前,豬場對這些廢氣只能做到一定程度上的控制,不能做到真正無害化。主要采取的控制方法有吸附法、焚燒法、化學與生物除臭劑法、洗滌法及生物過濾等[3-4],這些方法對H2S、NH3等有害氣體有一定的控制作用,但因成本問題或是二次污染問題而不能大規模運用。所以尋求一種經濟可行的廢氣無害化處理方案很有必要。

硫化物醌氧化還原酶(SQR）廣泛存在于光營養和化學營養細菌(綠菌屬、莢膜桿菌屬、著色菌屬等）中,它是1條57 000的多肽,能夠分解H2S[5-7]。1997年,Shütz等從莢膜紅桿菌中分離純化出SQR,并將SQR基因成功克隆于大腸桿菌中,結果顯示,大腸桿菌表達的SQR具有生物酶活性[6]。且SQR降解H2S的反應無需進入細胞內,即在細胞外進行[8]。所以利用SQR能夠降解H2S的特性,使動物腸道中存在適量的SQR,從而減少糞便中H2S的排放。綜合現在的分子生物學和細胞生物學手段,可以通過轉基因技術進行基因改造,獲得穩定表達SQR的轉基因動物,有望一定程度上解決畜禽糞便中H2S的污染問題。

腸道脂肪酸結合蛋白質(IFABP）是一類重要的脂肪酸轉運蛋白質,其特異表達于小腸上皮吸收細胞,與食物中長鏈脂肪酸(LCFA）的吸收、靶向運輸及代謝密切相關[9-10]。腸道脂肪酸結合蛋白質啟動子是IFABP特異表達于腸道的關鍵,相關研究結果顯示IFABP啟動子具有種間保守性,大鼠IFABP啟動子能夠啟動人生長激素在小鼠腸道中特異表達[10]。所以本研究利用大鼠IFABP啟動子構建SQR基因的腸道定向表達載體,并檢測其在小鼠腸道細胞中的表達情況,為下一步開展減少廢氣排放的轉基因動物新品種培育的相關研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 質粒及菌株

模板質粒pMD18-T-SQR-Myc由江蘇省農業科學院家禽研究室自行構建；載體質粒pcDNA3.1 (-）、pEGFP-C3由南京大學模式動物研究所高翔教授實驗室饋贈；中間載體質粒pMD-18T購自大連TaKaRa公司；大腸桿菌菌株DH5α由江蘇省農業科學院家禽研究室保存。

1.2 主要試劑

限制性內切酶NheI、XbaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ, Prime STAR高保真DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；去內毒素中量質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、快速連接試劑盒(Liga FastTM Rapid DNA Ligation System）購自Promega公司,轉染試劑LipofectamineTM LTX購自Invitrogen公司；胰蛋白酶,青、鏈霉素購自SIGMA公司；DMEM(高糖）、胎牛血清(FBS）購自GIBCO公司。

1.3 引物設計

根據SQR基因及綠色熒光蛋白質(GFP）基因序列,設計PCR反應引物P1、P2、P3與P4。引物P1、P2擴增SQR-Myc,P1帶有酶切位點XhoI及保護堿基；引物P3、P4擴增GFP,P4帶有酶切位點KpnI及保護堿基。根據GenBank中大鼠IFABP啟動子序列設計PCR引物P5、P6,P5帶有酶切位點NheI及保護堿基,P6帶有酶切位點XbaI及保護堿基。P1～P 6序列詳見表1。

表1 引物P1～P6序列Table 1 The sequences of promoters P1 to P6

1.4 pcDNA3.1-SQR-GFP重組質粒的構建

PCR重疊延伸擴增SQR-GFP：以pMD18T-SQRMyc為初始模板,P1、P2終濃度為1 μmol/L,PrimeSTAR高保真DNA聚合酶,50.0 μl體系擴增SQRMyc,并設為模板1,其循環條件為98℃10 s,48℃10 s,72℃85 s,共30個循環。以pEGFP-C3為初始模板,采用P3、P4終濃度1 μmol/L,50.0 μl體系擴增GFP,設為模板2,其循環條件為98℃10 s,52℃10 s,72℃40 s,共30個循環。膠回收后,等摩爾比混合模板1和2成為模板3,以模板3為模板,用引物P1與P4,50.0 μl體系擴增SQR-GFP,反應條件為98℃10 s,50℃10 s,72℃2 min,共30個循環。PCR反應體系(50.0 μl）：上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,DNA 1.0 μl,Prime STAR 0.5 μl, 5×Buffer 10.0 μl,dNTP 1.0 μl,dd H2O 37.0 μl。

pcDNA3.1-SQR-GFP重組質粒的獲得：模板3 PCR產物回收后用XhoⅠ與KpnⅠ酶切后連接到pcDNA3.1(-）,連接產物采用KCM法轉化大腸桿菌DH5α,經氨芐青霉素篩選,用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定。篩選陽性質粒即為pcDNA3.1-SQR-GFP重組質粒。

1.5 SQR腸道特異表達載體pcDNA3.1(-）-IFABP-SQR-GFP的構建

PCR擴增IFABP啟動子片段：以提取的大鼠基因組DNA初始模板[11],采用P5、P6終濃度1 μmol/L,使用Prime STAR高保真DNA聚合酶擴增IFABP,50.0 μl體系,循環條件為98℃10 s,48℃10s,72℃85 s,共30個循環。

pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP的連接及鑒定：將IFABP的PCR產物回收后用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切,純化回收1 352 bp的目的片段；同時用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1 (-）-SQR-GFP,將酶切回收后的pcDNA3.1(-）載體質粒和IFABP目的片段按摩爾比1∶3于0.2 ml的離心管中使用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物用KCM法轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,從轉化子的平板上隨機挑取菌落,擴增培養后提取質粒,酶切鑒定,經鑒定的陽性轉化子測序后保存菌液及質粒。擴大培養細菌并中量提取質粒pcDNA3.1(-）-IFABP-SQR-GFP,備用。

1.6 小鼠腸道上皮細胞分離及原代培養

使用組織塊培養法進行分離培養小鼠腸上皮細胞：①無菌條件下PBS液清洗小腸3次,剔除腸系膜,將小腸移至培養皿中,用PBS液將小腸內腔沖洗干凈。用眼科剪刀縱向剖開腸管,先用PBS液反復清洗,再用無血清的DMEM/F12清洗3次。清洗液中的抗生素為培養液中的3倍；②將腸管剪成肉眼可見的大碎片,用無血清的DMEM/F12清洗,靜置1～2 min使碎片自然沉降,棄去上清液,將腸組織剪成小于1 mm3的碎片,再轉移至50 ml的離心管中加無血清DMEM/F12,用移液管反復吹打,1 000 r/min離心7 min；③如上反復清洗組織塊直至上清液澄清；④用含5%FBS的DMEM/F12懸浮組織塊并取適量種植于培養皿或培養瓶中。⑤培養24 h后換液,繼續培養。

1.7 小鼠胎兒成纖維細胞的分離及原代培養

將懷孕12～14 d的母鼠斷頸處死,取子宮中的胎兒。去掉頭、四肢及內臟后,用剪刀剪碎,放入0.25%的胰蛋白酶中,37℃消化10～20 min。加入含10%(體積比）犢牛血清的DMEM/F12終止消化,機械吹打使細胞分散。取少量細胞懸液進行細胞計數后,向懸液中加入含10%犢牛血清的DMEM/F12,使終濃度為1 ml 5×105～8×105個。96孔培養板每孔中加入200 μl懸液,于37.5℃,5% CO2,100%濕度培養箱內培養。待細胞長成單層時換液,以后隔天換半液。待細胞長到100%匯合時進行傳代,繼續培養。

1.8 脂質體法轉染小鼠腸道上皮細胞及成纖維細胞

轉染體系如下：A管中100 μl無血清opti DMEM培養基加入3 μl脂質體,緩慢吹打40次,吹打過程中注意避免氣泡的產生。B管中100 μl無血清培養基加1 μg重組質粒,吹打數次使之混合均勻,避免氣泡產生。A、B管靜止5 min后將B管里的液體緩慢逐滴加入A管中,緩慢吹打40次使之混合均勻,吹打過程中避免產生氣泡,靜止30 min后滴加到細胞培養板中,輕晃培養皿使混合均勻,置培養箱37℃培養4～6 h,換成含10%FBS和1%雙抗的完全培養基。轉染48 h后于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-SQR-GFP重組質粒的構建

以pMD18T-SQR-Myc質粒為模板,使用引物P1、P2,擴增SQR片段,大小為1 334 bp(圖1A）。以質粒pEGFP-C3為模板,使用引物P3、P4,擴增GFP片段,大小為744 bp(圖1B）。

圖1 PCR擴增SQR、GFP片段電泳圖Fig.1 Profiling of SQR and GFP fragments amplified by PCR

以上述擴增產物SQR片段及GFP片段為模板,用引物為P1和P4,采用重疊PCR方法將兩種組件融合,得到SQR-GFP片段,該融合片段的大小為2 048 bp(圖2）。

圖2 SQR-GFP擴增片段電泳圖Fig.2 Electrophoresis of SQR-GFP fragment amplified by PCR

將構建好的pcDNA3.1-SQR-GFP重組質粒用限制性內切酶XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切,酶切產物電泳可見大小為2 038 bp和5 300 bp的條帶,與基因圖譜相符(圖3）。

圖3 pcDNA3.1-SQR-GFP酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion of pcDNA3.1-SQR-GFP

2.2 SQR腸道特異表達載體的構建

以大鼠基因組DNA為模板,使用引物P5、P6,擴增IFABP片段,大小為1 352 bp(圖4）。

將重組質粒pcDNA3.1(-）-IFABP-SQR-GFP用限制性內切酶NheI、XbaI雙酶切,酶切產物電泳可見大小為1 352 bp和約7 400 bp的兩條帶,與插入的目的片段和載體大小一致(圖5）。

2.3 SQR在腸道細胞中的特異表達

特異表達載體質粒pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP分別感染小鼠腸道上皮細胞及成纖維細胞48 h后,顯微鏡下觀察熒光(圖6）。圖6A和圖6B顯示腸上皮細胞中表達的GFP熒光蛋白質,而圖6C和圖6D中小鼠成纖維細胞中無綠色熒光蛋白質表達。可見,pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP在小鼠腸道上皮細胞中具有一定的表達特異性。

3 討論

圖5 pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP酶切鑒定Fig.5 Restriction enzyme digestion of pcDNA3.1-IFABP-SQRGFP

在轉基因動物相關研究中,構建合適的載體是重要的前提,本研究通過大鼠基因組擴增腸道脂肪酸結合蛋白質基因的啟動子,期望該基因啟動子在小鼠腸道上皮細胞中能夠特異啟動目的硫化物-醌氧化還原酶(SQR）基因的表達。研究結果表明,腸道脂肪酸結合蛋白質(IFABP）特異表達于小腸上皮細胞[9-10],IFABP啟動子是IFABP特異表達于腸道的關鍵,相關研究結果表明IFABP啟動子具有種間保守性。David等[10]研究結果表明,大鼠IFABP啟動子能夠啟動人生長激素在小鼠腸道中特異表達,表達范圍從十二指腸到末端結腸,其中在十二指腸,近端空腸,遠端空腸及回腸的表達量與IFABP本身表達量無明顯差異。同樣,本研究結果表明,大鼠IFABP啟動子能夠啟動SQR在小鼠腸道上皮中特異表達。以上結果都說明IFABP啟動子能夠啟動目的基因在小鼠腸道細胞中的特異表達。

圖6 pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP轉染48 h的熒光檢測Fig.6 Fluorescence detection for cells transfected with pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP for 48 h

由于IFABP啟動子插入位置在真核表達載體pcDNA3.1的多克隆位點,處于載體本身CMV啟動子下游,故有可能發生CMV啟動子啟動SQR表達的情況,但添加的IFABP啟動子序列,分別在IFABP的154～156堿基處均有TAA堿基序列,因此在理論上排除了CMV啟動子引發SQR表達的可能性,即原CMV啟動子不會發揮啟動作用,因此本試驗采用脂質體轉染法直接將pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP載體轉染細胞進行鑒定。

本試驗中,脂質體轉染后GFP的表達效率并不高,原因可能是轉染的原代小腸上皮細胞增殖很慢,且老化速度快,造成轉染效率低下。另一方面可能是IFABP啟動子的啟動效率不高,高效的表達效率還需要其他元件例如增強子等。因此下一步試驗應該從提高表達效率方面進行深入研究,為獲得高效表達SQR的特異表達載體作有力準備。

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(責任編輯：袁 偉）

Construction of directioned expression vector for sulfide-quinone reductase gene and its expression

YU Jian-ning1, YANG Yan-yan2, YU Feng-xiang3, SHI Xiao-yan4, XU Xiao-bo1, WANG Gong-jin1

(1.Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Animal Improvement and Reproduction,Nanjing 210014,China；2.Qingdao Botanical Gardens Management Office,Qingdao 266071,China；3.College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China；4.Department of Medical and Health Management,Jiangsu Food Science College,Huai′an 223003,China）

The directed expression vector pcDNA3.1(-）-IFABP-SQR-GFPfor sulfide-quinone reductase(SQR） gene were successfully constructed by means of nested PCR,intermediate vector and restriction enzyme ligation.The vector was transfected into mouse intestinal epithelial cells by lipofection for the expression ofSQRgene.The results revealed that the expression of green fluorescent protein was detected in mouse intestinal epithelial cells,indicative of the expression ofSQRgene initiated by the promotor of intestinal fatty acid-binding protein(IFABP）.

sulfide-quinone reductase(SQR）；directed expression vector；intestinal fatty acid-binding protein(IFABP）；intestinal epithelial cell

S634.3

A

1000-4440(2015）01-0100-06

于建寧,楊燕燕,于峰祥,等.硫化物醌氧化還原酶定向表達載體的構建及細胞轉染表達檢測[J].江蘇農業學報,2015,31 (1）：100-105.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.015

2014-07-24

農業部轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08006-004）；江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX(10）421]

于建寧(1980-）,女,山東煙臺人,博士,副研究員,研究方向為動物生物技術與繁殖內分泌。(Tel）025-84390336；(E-mail）jianningyu@aliyun.com

王公金,(E-mail）wgjphd@163.com