不同中藥多糖體外對雞外周血和脾臟淋巴細胞增殖能力的比較

蔣春茂, 陳曉蘭,, 陸廣富, 陳興穎, 王德云, 胡元亮, 耿千麗

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇泰州 225300；2.南京農業大學動物醫學院,江蘇南京 2100951）

不同中藥多糖體外對雞外周血和脾臟淋巴細胞增殖能力的比較

蔣春茂1, 陳曉蘭1,2, 陸廣富1, 陳興穎2, 王德云2, 胡元亮2, 耿千麗1

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇泰州 225300；2.南京農業大學動物醫學院,江蘇南京 2100951）

為比較玉竹多糖、桑葉多糖、杜仲多糖、商陸多糖、淫羊藿多糖體外增強免疫活性,采用酶學檢測法測定各中藥多糖對雞胚成纖維細胞的安全濃度,根據安全濃度測定結果,選擇250.000 μg/ml、125.000 μg/ml、62.500 μg/ml、31.250 μg/ml、15.625 μg/ml 5個濃度,用MTT法比較5種中藥多糖單獨和PHA協同刺激對外周血T淋巴細胞增殖指數的影響,以及比較5種中藥多糖單獨和LPS協同刺激對脾臟B淋巴細胞增殖率的影響。結果顯示,玉竹多糖、桑葉多糖、杜仲多糖、商陸多糖、淫羊藿多糖對雞胚成纖維細胞的安全濃度分別為1 250.0 μg/ml、625.0 μg/ml、625.0 μg/ml、625.0 μg/ml、312.5 μg/ml。玉竹多糖、桑葉多糖、杜仲多糖和淫羊藿多糖無論是單獨還是協同PHA刺激外周血T淋巴細胞,均不同程度地表現出增強T淋巴細胞的活性。桑葉多糖、杜仲多糖和淫羊藿多糖無論是單獨還是協同LPS刺激脾臟B淋巴細胞,均不同程度地顯示出良好的增強B淋巴細胞的活性。桑葉多糖和杜仲多糖體外增強免疫效果最佳,在62.500 μg/ml和125.000 μg/ml時,均顯示出較強的增強外周血T淋巴細胞和脾臟B淋巴細胞增殖的能力。

中藥多糖；淋巴細胞增殖；植物血凝素(PHA）；脂多糖(LPS）

動物的病毒性傳染病,如高致病性禽流感[1]、新城疫[2]、傳染性法氏囊病[3]等,嚴重危害畜牧業的發展,造成嚴重的經濟損失,一直受到廣泛的關注[4]。然而,單獨使用疫苗效果普遍較差,通常都需要配合相應的佐劑才能達到滿意的免疫效果。但目前常用的鋁鹽和礦物油佐劑卻存在許多缺點,因此,研發高效低毒的新型免疫佐劑成為當前防控動物傳染性疾病的熱點。

大量研究結果表明,許多中草藥及其有效成分單獨或者組成復方配伍使用都具有良好的免疫增強活性[5],其毒副作用小,殘留污染低[6],來源廣泛,便于應用。因此,研發以中草藥有效成分為主的新型免疫佐劑將成為今后畜禽免疫增強劑的發展趨勢。

諸多研究結果表明,一些藥食兩用中藥多糖具有一定的免疫調節功能,表現出不同程度的免疫增強活性。鑒于此,本研究選擇玉竹多糖、桑葉多糖、杜仲多糖、商陸多糖、淫羊藿多糖為研究對象,在測定以上多糖最大細胞安全濃度的基礎上,通過單獨刺激和協同PHA(Phytohaemagglutinin）或LPS(Lipopolysaccharide）共同刺激,比較5種中藥多糖5個濃度下對雞外周血T淋巴細胞增殖指數或對脾臟B淋巴細胞增殖率的影響,旨在篩選出體外免疫活性最好的中藥多糖,為進一步研究其體內免疫增強作用效果奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 中藥成分的制備

選擇桑葉、杜仲皮、玉竹、商陸、淫羊藿五種中藥原料,分別制備桑葉多糖、杜仲多糖、玉竹多糖、商陸多糖、淫羊藿多糖。各中藥多糖均采用水提醇沉法制備,用苯酚-硫酸法進行多糖含量測定,所得多糖的含量為：桑葉多糖29.83%、杜仲多糖31.02%、玉竹多糖96.09%、商陸多糖45.76%、淫羊藿多糖66.38%。將各中藥成分配成10 mg/ml濃度,用于最大細胞安全濃度測定。再根據安全濃度測定結果,用RPMI 1640將各中藥多糖分別配成250.000 μg/ml、125.000μg/ml、62.500μg/ml、31.250 μg/ml、15.625 μg/ml系列濃度,用于體外淋巴細胞增殖試驗。

1.2 主要試劑與儀器

小牛血清,杭州四季青生物制品廠生產；RPMI 1640培養液,Gibco公司產品；Hank's液,自制；四甲基偶氮唑藍(MTT）,北京廣源恒信科技發展有限公司生產；植物血凝素(PHA）,南京奧多福尼生物科技有限公司生產；脂多糖(LPS）,Sigma公司生產；二甲基亞砜(DMSO）(分析純）,上海凌峰化學試劑有限公司生產；磷酸鹽緩沖液(PBS）(pH 7.1～7.3）,自配。

TS100型倒置顯微鏡,Nikon公司生產；CO2培養箱,America Revco公司生產；RT-6000型酶聯免疫檢測儀,深圳雷杜生命科學股份有限公司生產；75-2A型微量振蕩器,上海醫用分析儀器廠生產；細胞培養板,德國Nunclon公司生產；BS110S型電子天平,Sartorius公司生產。

1.3 最大細胞安全濃度測定

選擇10日齡雞胚,調節細胞至適當密度后置于96孔細胞培養板中,在CO2培養箱中37℃培養24 h,棄去細胞生長液,用Hanks液清洗后每孔加入系列濃度的中藥多糖(2 000.000 μg/ml、1 000.000 μg/ml、500.000 μg/ml、250.000 μg/ml、125.000 μg/ml、62.500μg/ml、31.250μg/ml、15.625 μg/ml、7.813 μg/ml、3.906 μg/ml）100 μl,4次重復,設細胞和空白對照。繼續培養72 h,觀察細胞有無病變,若各重復孔均無病變,則采用MTT法測定各孔OD值,以加藥孔OD值不顯著低于細胞對照孔OD值的最高濃度作為最大細胞安全濃度。

1.4 雞外周血T淋巴細胞增殖試驗

用MTT法比較各中藥成分增強免疫活性[5]。無菌取雞心臟血液,分離淋巴細胞于96孔細胞培養板中,設PHA和細胞對照組,除空白孔外每孔加入系列濃度中藥多糖100 μl,培養44 h取出,每孔分別加入MTT 30 μl,繼續培養4 h后,加DMSO顯色并震蕩后測定吸光值(A570）,以及刺激指數(SI）,SI=試驗孔A570平均值/對照孔A570平均值,作為淋巴細胞增殖的指標。刺激指數大于1時,表明有明顯的刺激作用。

1.5 雞脾臟B淋巴細胞增殖試驗

無菌取出成年健康雞脾臟,收集脾細胞懸液并稀釋至1 ml 5×106個,加入至96孔細胞培養板中,設LPS對照,除細胞對照組外各孔加入系列濃度中藥成分100 μl,4次重復。培養44 h取出,每孔分別加入MTT 30 μl,繼續培養4 h后,加DMSO顯色并震蕩后測定吸光值(A570）,作為B淋巴細胞增殖的指標。并按公式計算淋巴細胞增殖率[8]：增殖率=

2 結果

2.1 各中藥多糖細胞安全濃度

表1顯示,玉竹多糖對雞胚成纖維細胞(CEF）的最大安全藥物濃度為1 250.000 μg/ml,桑葉多糖、杜仲多糖、商陸多糖最大安全藥物濃度為625.000 μg/ml,淫羊藿多糖最大安全藥物濃度為312.500 μg/ml。各中藥多糖在最大安全濃度以下多個濃度水平均顯示出一定的促細胞生長作用。

表1 中藥多糖對雞胚成纖維細胞生長的影響Table 1 The influence of Chinese herbal medicine polysaccharides on the growth of chicken embryonic fibroblast(CEF）

2.2 各中藥多糖單獨刺激外周血T淋巴細胞增殖的變化

各中藥多糖單獨刺激時外周血T淋巴細胞刺激指數見表2。玉竹多糖在125.000～250.000 μg/ml濃度時,對外周血T淋巴細胞刺激指數顯著高于低濃度。桑葉多糖在62.500～250.000 μg/ml濃度時,顯著高于低濃度,且125.000 μg/ml濃度時刺激指數最高。杜仲多糖62.500～125.000 μg/ml濃度時顯著高于其他濃度,且62.500 μg/ml濃度時刺激指數最高。商陸多糖在250.000 μg/ml濃度時刺激指數最高,且顯著高于其他濃度,其他4個濃度間的刺激指數無顯著性差異。淫羊藿多糖在31.250～62.5.000 μg/ml濃度時顯著高于其他濃度,在250.000 μg/ml濃度時表現出較低的刺激指數。

表2 中藥多糖單獨刺激時外周血T淋巴細胞刺激指數(SI）Table 2 T lymphocyte stimulation index(SI）of peripheral blood stimulated alone by Chinese herbal medicine polysaccharides

2.3 各中藥多糖協同PHA刺激外周血T淋巴細胞增殖的變化

各中藥多糖協同PHA刺激外周血T淋巴細胞時刺激指數見圖1。玉竹多糖在125.000～250.000 μg/ml濃度時,協同PHA刺激時外周血T淋巴細胞刺激指數顯著高于低濃度。桑葉多糖在62.500～250.000 μg/ml濃度時,刺激指數顯著高于低濃度,且125.000 μg/ml濃度時刺激指數最高。杜仲多糖在62.500～125.000 μg/ml濃度時,刺激指數顯著高于其他濃度,且62.500 μg/ml濃度時刺激指數最高。商陸多糖在250.000 μg/ml濃度時,刺激指數顯著高于低濃度,在15.625～125.000 μg/ml濃度時各濃度間無顯著性差異。淫羊藿多糖在31.250～62.500 μg/ml濃度時刺激指數最高,且顯著高于其他濃度。

圖1 不同中藥多糖協同PHA刺激外周血T淋巴細胞刺激指數Fig.1 T lymphocyte stimulation index(SI）of peripheral blood co-stimulated by PHA and Chinese herbal medicine polysaccharides

2.4 中藥多糖單獨刺激對脾臟B淋巴細胞增殖率的影響

中藥多糖單獨刺激脾臟B淋巴細胞增殖率見圖2。玉竹多糖在31.250～250.000 μg/ml濃度時,顯著高于15.625 μg/ml濃度。桑葉多糖在125.000 μg/ml濃度時增殖率最高,顯著高于其他各濃度。杜仲多糖在62.500 μg/ml濃度時顯著高于其他各濃度,在125.000～250.000 μg/ml濃度時亦顯著高于15.625 μg/ml和31.250 μg/ml 2個濃度。商陸多糖和淫羊蕾多糖在250.000 μg/ml濃度時顯著高于15.625～61.250 μg/ml 3個濃度。

圖2 中藥多糖單獨刺激脾臟B淋巴細胞增殖率Fig.2 Spleenic B lymphocyte proliferation rate stimulated alone by Chinese herbal medicine polysaccharides

2.5 中藥多糖協同LPS刺激對脾臟B淋巴細胞增殖率的影響

中藥多糖協同LPS刺激脾臟B淋巴細胞增殖率見圖3。玉竹多糖在250.000 μg/ml濃度時,脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于15.625 μg/ml濃度。桑葉多糖在31.250～250.000 μg/ml濃度時均顯示出較高的增殖率,顯著高于15.625 μg/ml濃度,且在125.000 μg/ml濃度時最高。杜仲多糖在31.250～250.000 μg/ml濃度時脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于15.625 μg/ml濃度。商陸多糖在250 μg/ml濃度時脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于31.250 μg/ml和15.625 μg/ml 2個濃度。淫羊藿多糖在250.000 μg/ml濃度時脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于15.625 μg/ml、31.250 μg/ml和62.500 μg/ml 3個濃度。

3 討論

酶學比色法是目前細胞免疫學檢測中的一種常用方法。用該法檢測藥物對免疫細胞活性的影響,不僅操作簡單、安全,而且客觀準確,容易定量[7]。本試驗選擇雞胚成纖維細胞(CEF）作為免疫細胞,測定5種中藥多糖對CEF的最大安全濃度。結果顯示,桑葉多糖、杜仲多糖、商陸多糖具有相同的安全濃度,為625 μg/ml,玉竹多糖安全濃度最大,而淫羊藿多糖安全濃度最低。各中藥多糖在最大安全濃度以下多個濃度水平均顯示出一定的促細胞生長作用。

圖3 不同中藥多糖協同LPS共同刺激脾臟B淋巴細胞增殖率Fig.3 Spleenic B lymphocyte proliferation rate co-stimulated by LPS and Chinese herbal medicine polysaccharides

淋巴細胞增殖是反應機體細胞免疫最直接的指標[8]。T細胞具有介導細胞免疫及調節免疫的雙重功能,其能識別和提呈抗原,特別是TH細胞核TS細胞能調節B淋巴細胞增殖和分化[9]。因此,監測T細胞增殖的變化是研究藥物活性和作用機制的最好的方法。PHA作為有絲分裂原,在體外可以刺激T淋巴細胞的活化分裂增殖。通常將藥物單獨刺激和PHA協同刺激T淋巴細胞增殖作為判定中藥體外對細胞免疫的調節功能的基本指標。各中藥多糖單獨和協同PHA刺激外周血T淋巴細胞增殖指數結果顯示,5種中藥多糖無論是單獨還是協同PHA刺激外周血T淋巴細胞,除了桑葉多糖和淫羊藿多糖出現過刺激指數小于1,其余均大于1,說明5種多糖體外均不同程度地表現出增強T淋巴細胞的活性。各中藥多糖單獨和協同PHA刺激外周血T淋巴細胞增殖指數結果顯示,在62.500～125.000 μg/ml時,玉竹多糖、桑葉多糖和杜仲多糖刺激指數高于其它多糖,且桑葉的效果最好。250.000 μg/ml時,玉竹多糖和桑葉多糖刺激指數最大,而杜仲高濃度時增殖指數較小,可能高濃度對細胞產生了抑制作用。而商陸多糖在不同濃度其增殖指數較小,說明其對T淋巴細胞無顯著的刺激增殖能力。類似的研究結果也有報道,桑葉多糖可極顯著提高巨噬細胞吞噬百分率、吞噬指數和T、B淋巴細胞功能(P＜0.01）[10]。

脾臟是雞重要的免疫器官,脾臟中B淋巴細胞約占脾內淋巴細胞總數55%。B淋巴細胞是機體中參與免疫應答的重要細胞類群,主要參與體液免疫[11]。監測脾臟中B細胞增殖的變化亦是研究藥物活性的常用方法之一。而有絲分裂原LPS能刺激B淋巴細胞的活化分裂增殖,通常將藥物單獨刺激和LPS協同刺激脾B淋巴細胞增殖作為判定中藥體外對細胞免疫調節功能的基本指標[12]。本研究結果顯示,5種中藥多糖中,桑葉多糖、杜仲多糖、淫羊藿多糖單獨刺激時脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于玉竹多糖和商陸多糖。桑葉多糖在125.000 μg/ml時脾臟B淋巴細胞增殖率顯著高于其他濃度,高濃度時呈現一定的抑制作用。杜仲多糖在62.500 μg/ml時增殖率顯著高于其他濃度,濃度升高也呈現明顯的抑制作用。而淫羊藿多糖在250.000 μg/ml時增殖率最大,呈現一定的劑量依賴關系。LPS與中藥多糖共同刺激脾B淋巴細胞增殖率結果顯示,經LPS誘導后,各中藥多糖刺激淋巴細胞增殖率明顯增高。桑葉多糖和杜仲多糖在62.500 μg/ml、125.000 μg/ml時,經LPS協同作用顯示出很強的促進脾臟B淋巴細胞增殖的能力,淫羊藿多糖次之,而玉竹和商陸多糖較弱。有類似的研究報道稱桑葉多糖與刀豆蛋白A(ConA）協同作用,誘導小鼠脾淋巴細胞轉化能力,具有增強小鼠免疫功能的作用[13]。而與王洪斌[14]報道的商陸多糖體外能顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖,促進絲裂原誘導的淋巴細胞轉化及雙向混合淋巴細胞反應結果不一致。

綜上所述,玉竹多糖、桑葉多糖、杜仲多糖具有較高的安全濃度,在62.500～125.000 μg/ml時,與15.625 μg/ml比較,無論是單獨刺激還是協同PHA均能顯著地誘導外周血T淋巴細胞增殖,產生較高的刺激指數。桑葉多糖、杜仲多糖在62.500～250.000 μg/ml時,與15.625 μg/ml比較,無論是單獨刺激還是協同LPS均能顯著地提高脾臟B淋巴細胞增殖率,且桑葉多糖在125.000 μg/ml時,杜仲多糖在62.500 μg/ml時,具有最強的促進脾臟B淋巴細胞增殖的能力。

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(責任編輯：陳海霞）

Comparative study on chicken peripheral lymphocyte and spleen lymphocyte proliferation by Chinese herbal medicinal polysaccharides in vitro

JIANG Chun-mao1, CHEN Xiao-lan1,2, LU Guang-fu1, CHEN Xing-ying2, WANG De-yun2, HU Yuan-liang2, GEN Qian-li1

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China；2.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China）

Polygonatum odoratumpolysaccharide(POPS）,morus polysaccharide(MPS）,eucommia polysaccharide (EPS）,pokeweed polysaccharide(PPS）,and epimedium polysaccharide(EPPS）to chicken embryonic fibroblast(CEF）in vitrowere determined and showed as follows compared.1 250.0 μg/ml,625.0 μg/ml,625.0 μg/ml,625.0 μg/ml,and 312.5 μg/ml,respectively.The effects of above five polysaccharides applied solely or co-applied with phytohaema glutinin (PHA）on the proliferation of peripheral blood T lymphocytes and the effects of five paly saccharides appiied solely or co-applied with lipopolysaccharide LPS on the proliferation of spleenic B lymphocytes were compared.POPS,MPS, EPSand EPPScould enhance peripheral blood Tlymphocytes activity at different levels either stimulated alone or co-stimulated with PHA.MPS,EPSand EPPScould improve spleenic B lymphocytes activity at different levels either stimulated alone or co-stimulated with LPS.The im-mune enhancements of MPSand EPSin vitrooutperformed others at the concentration of 62.5 μg/ml and 125 μg/ml.

Chinese herbal medicinal polysaccharide；lymphocyte proliferation；phytohaemagglutinin(PHA）；lipopolysaccharide(LPS）

S853.74

A

1000-4440(2015）01-0106-06

蔣春茂,陳曉蘭,陸廣富,等.不同中藥多糖體外對雞外周血和脾臟淋巴細胞增殖能力的比較[J].江蘇農業學報,2015,31(1）：106-111.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.016

2014-06-20

江蘇省自然科學基金面上項目(BK2011537）；江蘇省農業三新工程項目[SXGC(2013）291]；江蘇農牧科技職業學院鳳凰人才專項(NSFFH1303）；江蘇省大學生實踐創新項目(201412806016Y）；學院重點項目(NSFZD1404）

蔣春茂(1962-）,男,江蘇靖江人,博士,教授,主要從事新獸藥研發。