HBV感染者DNA模板庫的制備*

鄧春青 馮珊珊

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個嚴重的公共衛生問題，我國1992年的血清流行病學調查結果提示：國內一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）陽性率為9.75%[1]，屬于HBV感染的高流行區。HBV感染后容易慢性化，與肝硬化和肝癌的發生顯著相關，部分還可轉變為重型肝炎[2]。目前在HBV感染的遺傳易感性研究中，疾病關聯研究最常用。筆者進行HBV感染候選基因的關聯研究所需的大樣本量較歐、美等發達地區更具優勢。關鍵之處則在于將收集的大量樣本抽提出DNA并制備成分型所用96孔模板，這無疑是進行疾病關聯研究的基礎和前提。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象選擇本院傳染科門診及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地區漢族居民，靜脈抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血：5 mL用于基因組DNA提取；5 mL用于病毒標志和生化檢測；同時填寫詳細的臨床資料并輸入計算機。樣本收集過程按照國家人類基因組研究倫理學準則進行，獲得了收集對象的知情同意。乙型肝炎依據2000年西安第十次全國病毒性肝炎會議修訂“病毒性肝炎防治方案”制定標準診斷[3]，另外筆者收集了部分血站獻血員作為正常對照。

1.2 方法

1.2.1 人白細胞基因組DNA提取 采用Miller鹽析法[4]進行。（1）EDTA-K2抗凝全血5 mL，置于50 mL有蓋圓底離心管內。（2）加6~8倍體積（約35~40 mL）蒸餾水，反復顛倒混勻，于4 ℃ 5000 g離心20 min。（3）傾倒上清后于沉淀中加入預冷的0.1%Triton-X100（約35~40 mL），輕柔混勻沉淀，再次于4 ℃ 5000 g離心20 min，然后棄上清。（4）加入2 mL裂解液于沉淀中，徹底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μL至終濃度為0.5%，混勻。（5）加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至終濃度為200 μg/mL，混勻，于55 ℃4 h或37 ℃過夜消化。（6）加入6.0M NaCl液0.7 mL，劇烈振蕩20 s。（7）7000 g離心20 min，將上清移至50 mL有蓋圓底離心管內。（8）加入2倍體積-20 ℃無水乙醇或95%乙醇，反復顛倒混勻，直至出現絮狀沉淀，挑出DNA至一eppendorf管中。（9）1 mL 75%乙醇洗滌DNA兩遍。自然晾干，用200 μL TE溶解DNA（4 ℃需要3~7 d）。（10）75%乙醇中的DNA離心，棄上清。（11）凝膠電泳確定所提DNA，UV計測定純度和濃度，于TE中-20 ℃凍存。

1.2.2 模板的制備 （1）將所抽提的DNA樣本定量后加水稀釋至終濃度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。（2）每個96孔PCR板的最后2孔設為空白對照不加DNA樣本。（3）用鋁箔膠帶封口。（4）于Eppendorf Centrifuge 5810R冷凍離心機中離心5 min。（5）置-20 ℃冰箱凍存備用。

2 結果

歷時將近兩年，去除因各種原因資料不全以及極少數抽提DNA不理想的樣本，共收集到2561份DNA標本，全部制備成96孔模板。其中，男1940例，女621例，年齡21~75歲。

收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎（AHB）15例，乙肝病毒攜帶者（AsC）279例，慢性乙型病毒性肝炎（CHB）1497例，肝癌（HCC）23例，肝硬化（LC）218例，重型乙型病毒性肝炎（SHB）168例，自身免疫性肝炎（AIH）15例，慢性丙型病毒性肝炎（CHC）16例，原發性膽汁性肝硬化（PBC）5例，其他原因所致疾病（Others）104例，同時收集正常獻血員（BD）221例，詳細患者臨床資料見表1。

表1 所選患者臨床資料

圖1 全血基因組DNA

圖2 鋁箔膠帶封口96孔模板

3 討論

乙型肝炎呈世界性流行，不同地區HBV感染的流行強度差異很大，據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發性肝癌。因此，它已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種疾病。本試驗所收集到的HBV感染病例中，急性感染者僅占0.68%（15/2200），其余分別表現為慢性肝炎、乙型肝炎病毒攜帶、肝硬化甚至肝癌等慢性HBV感染狀態。當然，除歸結于諸多隱性HBV感染外[6]，HBV感染所致較高慢性化程度的本質也暴露無疑。筆者收集的病例包括乙肝病毒攜帶者、急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等HBV感染所致的所有疾病譜。而且在收治的所有肝病中，確診有HBV感染的占94.02%（2200/2340），再一次強勢表明HBV感染仍是今后較長時期面臨的主要疾病[5]，因而有關HBV感染的研究也將任重而道遠。此外，自身免疫性肝病作為一種發病機理不明的疾病與許多疾病有關聯，且由于最初的臨床癥狀與病毒性肝炎癥狀相似，臨床上診斷比較困難。因此，準確及時地監測出自身免疫性肝病的特異性自身抗體無疑對診斷以及進一步治療具有重要意義。臨床上最典型的自身免疫性肝病包括：原發性膽汁性肝硬化（PBC）和自身免疫性肝炎（AIH）。隨著檢測水平的不斷提高和檢測手段的日趨完善，原發性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎等諸多自身免疫性肝病的診斷一定會愈來愈受到重視。

以生物學功能相關的基因作為候選基因進行疾病關聯研究，是當前宿主遺傳易感性研究的主要策略。關聯研究是一種簡單、實用的分析技術，就是發現存在于大量數據集中的關聯性或相關性，從而描述了一個事物中某些屬性同時出現的規律和模式。關聯研究不必知道疾病的遺傳模式、表現型比率、不完全外顯率、遺傳異質性等，便于設計及開展，而且大量樣本可產生重復性良好的結果。關聯研究最重要的是應該避免因群體混雜或分層而出現的虛假的陽性關聯結果，為避免這種情況的發生，可采取一些措施：臨床分型詳細、適當；病例和對照應受相同病因作用，排除疾病異質性；樣本量足夠大；病例/對照性別、年齡匹配。本試驗中筆者所收集到的樣本量足夠大，病例和對照人群來自太原地區，病例與對照之間的年齡、性別基本匹配，臨床分型嚴格按照西安全國肝病會議制定的診斷標準執行，保證了進行關聯研究的需要。

由于分散性的進行樣本收集，筆者采取了一定的策略：零星收集標本后凍存，然后集中進行提取。收集標本的同時填寫詳盡的臨床學資料并錄入電腦，這樣排除了樣本重復的可能。筆者還將患者既往情況、既往住院病歷從信息科一一調出核查證實以確保詳實地反映患者的疾病狀況尤其是HBV感染狀態、肝臟功能等，另外，筆者收集標本、抽提DNA以及制作模板的過程當中，完全按所收集標本時間的先后順序依次完成，始終未將患者的診斷考慮在內，從而保證了樣本的隨機性。

制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100~200 kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續的試驗打下基礎。電泳鑒定提取的DNA如果不成區帶，而是散開，則說明DNA已經被降解成小分子，不能再用來進行限制性酶切等基因研究。本試驗所抽提人基因組DNA成完整區帶，濃度較高、純度較好、質量相當穩定，證實靜脈血仍然是提取基因組DNA的最佳標本[7]。商業化DNA抽提試劑盒以及既往傳統的酚/氯仿抽提法均需要分離外周血白細胞[8-9]，無法有效提取凍存血樣；實際操作可行性小，以試劑盒提取大樣本量的DNA花費過高，對筆者所收集的如此龐大的病例標本來說無疑代價高昂。在初始采用鹽析法提取凍存全血基因組的過程中，筆者發現37 ℃過夜消化或加入蛋白酶K后于55 ℃消化4 h兩者之間所提取的DNA有較大差別。無論所提取DNA的濃度、質量或者穩定性，經37 ℃過夜消化后均明顯優于55 ℃消化4 h。故此筆者之后基本采取了加入蛋白酶K后于37 ℃過夜消化的方法。總而言之，采用鹽析法提取凍存全血基因組DNA方便、經濟，所提DNA質量穩定，UV計測定純度和濃度后顯示足以滿足PCR擴增的需要。以此模板庫為基礎，誕生了許多重要的研究[10-15]。

[1] Chu C J，Lok A S.Clinical significance of hepatitis B virus genotypes[J].Hepatology（Baltimore，Md.），2002，35（5）：1274-1276.

[2]莊輝.流行病學[M].第2版.北京：人民衛生出版社，1996：721-738.

[3]中華醫學會.中華醫學會第十次全國病毒性肝炎及肝病學術會議論文匯編[C].西安，2000.

[4] Miller S A，Dykes D D，Polesky H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J].Nucleic Acids Research，1988，16（3）：1215.

[5] Revill P，Yuan Z.New insights into how HBV manipulates the innate immune response to establish acute and persistent infection[J].Antiviral Therapy，2013，18（1）：11-15.

[6] Allain J，Mihaljevic I，Gonzalez-Fraile M I，et al.Infectivity of blood products from donors with occult hepatitis B virus infection[J].Transfusion，2013，53（7）：1405-1415.

[7]范海榮，夏永靜，孫福成，等.四種全血基因組DNA提取方法的比較[J].中國動脈硬化雜志，2002，10（6）：535-536.

[8]盧圣棟主編.現代分子生物學實驗技術[M].第2版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：677.

[9]秦斌.四氫葉酸還原酶基因C677T突變與阿爾茨海默病有關[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2002，9（4）：230-234.

[10] Yan Z，Tan S，Dan Y，et al.Relationship between HLA-DP gene polymorphisms and clearance of chronic hepatitis B virus infections：case-control study and meta-analysis[J].Infect Genet Evol，2012，12（6）：1222-1228.

[11] Deng C Q，Deng G H，Wang Y M.HMGB1 gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].World Journal of Gastroenterology，2013，19（31）：5144-5149.

[12] Yan Z，Tan W，Dan Y，et al.Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and risk of HBV-related acute liver failure in the Chinese population[J].BMC Med Genet，2012，13（7）：49.

[13]王丹，鄧春青，趙龍鳳.HMGB1基因多態性與HBV相關性肝癌的關聯性研究[J].中國醫學創新，2014，11（12）：13-15.

[14]劉蒙，趙龍鳳.維生素D受體基因多態性與慢性乙型肝炎患者的關聯研究[J].中國醫學創新，2014，11（12）：22-24.

[15]羅昊翔，冉光鑫.乙型肝炎病毒父嬰傳播易感因素與預防[J].中國醫學創新，2014，11（6）：138-139.