木瓜蛋白酶在離子液體雙水相中的分配行為

王偉濤，蔣志國，張海德，彭健，許英豪，董安華，楊雪芳，蔣欣欣

（海南大學食品學院，海南 海口 570228）

引 言

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）是由 212個氨基酸殘基組成的蛋白質單鏈，具有耐高溫、穩定性好、蛋白水解能力強等特征，在食品、醫藥等領域有廣泛的應用[1-3]。對木瓜蛋白酶的分離純化技術進行深入研究，提取高品質的木瓜蛋白酶具有重要的應用價值。而傳統提取木瓜蛋白酶的方法存在酶活性不穩定、純度不高、工藝煩瑣且很難大規模生產，不能滿足現代工業的需求[4]，因此有必要尋找制備高品質、高活性木瓜蛋白酶的新方法。

雙水相萃取技術(ATPS)是近幾年出現的、非常有應用前途的一種新型生物化工分離技術。雙水相萃取技術的特點主要有[5-7]：①兩相間的界面張力小，有利于強化相際間的物質傳遞；②操作條件溫和，體系含水量高，在接近生理環境的體系中進行萃取，有助于保持生物活性；③傳質和平衡速度快，回收率高，分相的時間短，能耗較低；④成相的聚合物（如PEG）對人體無害，對環境污染小；⑤可以采用多種手段來提高選擇性和回收率；⑥易于連續化操作，設備簡單，所以雙水相技術特別適合生物活性物質的萃取[8-10]。

離子液體是近十年來迅速發展起來的一種全新綠色介質和功能材料，具有不易揮發、不可燃、穩定性高、溶解能力強、功能可調節等優點，其應用領域正不斷擴大。離子液體雙水相體系（ionic liquids aqueous two-phase system，ILATPS）一般是由親水性離子液體、無機鹽和水形成的雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優點[11]。作為一種新型高效的綠色分離體系，與傳統聚合物雙水相體系相比，離子液體雙水相具有黏度低、分相快、不易乳化、回收率高、離子液體可以循環利用等優點，因此越來越受到學術界及產業界的重視。目前，利用離子液體雙水相萃取的蛋白質、氨基酸、酶等活性物質已達數十種[12-18]。

目前，雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究國內外已有報道，但主要集中在PEG/鹽雙水相系統[2,19-23]。曹對喜等[20]建立了 PEG/(NH4)2SO4體系提取木瓜蛋白酶，探討了 PEG 分子量、PEG 質量分數、(NH4)2SO4質量分數、pH以及粗酶添加量對木瓜蛋白酶萃取效果的影響，酶活回收率為89.30%。涂紹勇等[22]對 PEG/(NH4)2SO4雙水相系統提取木瓜蛋白酶進行了研究，得到雙水相體系最佳條件為：PEG600 27%、(NH4)2SO421%、pH 7.0 和溫度 60℃。Nitsawang等[2]對比研究了雙水相萃取法與兩步鹽析法對木瓜蛋白酶的純化效果，采用8% PEG/15%(NH4)2SO4雙水相體系分離純化木瓜蛋白酶的純度較兩步鹽析法高，并減少了提取時間，但未對雙水相體系進行系統的優化。Ling等[19]將活性染料Reactive Red 120 添加到PEG/(NH4)2SO4雙水相系統中，對木瓜蛋白酶分配的成相條件進行了優化，木瓜蛋白酶的分配比為1.92，得率為50.09%。但是，體系中加入的游離親和染料Reactive Red 120 對木瓜蛋白酶的分配無影響。

相對離子液體雙水相，聚乙二醇雙水相存在黏度大，后續酶的分離較困難；分相慢，有些PEG雙水相系統需要離心才能徹底分相；易乳化，單次酶處理量不多；以及萃取率不高等現象[24]。本文擬把離子液體雙水相應用于木瓜蛋白酶的提取，可為該體系的放大實驗和工業化大規模生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木瓜蛋白酶（生化酶3500 U·mg?1），生工生物(上海)股份有限公司；[C2mim]Cl、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C4mim]Br、[C4mim]BF4，上海成捷化學有限公司；K2HPO4（分析純）、NaH2PO4（分析純），廣州化學試劑廠；其他都為市售分析純。

TU1901紫外可見分光光度計，北京普析通用有限責任公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；FTIR-850傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發展股份有限公司。

1.2 實驗方法

（1）木瓜蛋白酶活性的測定 以酪蛋白為底物，測定木瓜蛋白酶的活性[3]。

（2）蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法測定雙水相中木瓜蛋白酶蛋白質的濃度[25]。

（3）離子液體對酶活性的影響 配制質量分數為 5.0%、15.0%、25.0%、35.0%、45.0%的離子液體，各取2.0 ml加1.0 ml稀釋一定倍數的酶溶液，放置10.0 min后測其酶活性。空白取2.0 ml去離子水加1.0 ml稀釋相同倍數的酶溶液，放置10.0 min后測其酶活性。以酶活性比X為指標，考察各成相試劑對酶活性的影響。

（4）離子液體雙水相體系提取木瓜蛋白酶 取5.0 ml刻度冷凍管，加入0.25 g·ml?1（離子液體質量/體系體積，以下同）的離子液體、0.35 g·ml?1的K2HPO4、2.0 mg·ml?1（木瓜蛋白酶的質量/體系體積，以下同）木瓜蛋白酶溶液，體系pH 7.0，30℃。研究酸度影響時加入不同pH的B.R緩沖溶液1.0 ml，加去離子水至5.0 ml，空白加與酶溶液相同pH和等體積的酶稀釋液，30℃振蕩30 min，靜置至分相。讀取上下相的體積V，測定上相的蛋白濃度（mg·ml?1）和酶活性濃度（U·ml?1），計算公式如下

式中，Ye為酶活性回收率，%；Etop為上相酶活性濃度，U·ml?1；Vtop為上相體積，ml；Me為加入體系的總酶活性，U。

式中，Yp為蛋白回收率，%；Ptop為上相蛋白濃度，U·ml?1；Mp為加入體系的總蛋白質量，mg。

式中，SA為木瓜蛋白酶比活力，U·mg?1；E為酶活性濃度，U·ml?1；P為可溶性蛋白濃度，mg·ml?1。

式中，PF為純化因子；SAtop為上相酶的比活力；SAI為初始酶的比活力。

（5）木瓜蛋白酶在萃取體系中的結構表征 為了鑒定萃取后木瓜蛋白酶的結構，分別表征了水溶液和離子液體中木瓜蛋白酶的 UV-vis吸收光譜以及木瓜蛋白酶、離子液體、離子液體中木瓜蛋白酶的FT-IR吸收光譜。

（6）數據處理 采用Origin8.0對數據進行處理，每組均重復 3次，數據表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的離子液體溶液對酶活性的影響

配制質量分數為5.0%、15.0%、25.0%、35.0%、45.0%的離子液體，固定 pH 8.0（添加 HCl或者NaOH），溫度 30℃，考察不同濃度的離子液體對酶活性的影響，結果見圖1。由圖1可知，在較低濃度（35%以下）時，成相物質的存在對酶活性沒有明顯的抑制作用，即使成相物濃度達到 35%，酶活性比仍在 85%以上，其中離子液體[C2mim]Cl對酶活性反而還有促進作用；隨著成相劑濃度的進一步增加，對酶活性的抑制作用加強，故成相時離子液體的濃度不宜太大，控制在35%（質量分數）以下。

圖1 不同濃度的離子液體溶液對酶活性的影響Fig.1 Effect of concentration of ionic liquids on activity of enzyme

圖2 不同pH的離子液體溶液對酶活性的影響Fig.2 Effect of pH of ionic liquids on activity of enzyme

2.2 不同pH的離子液體溶液對酶活性的影響

配制質量分數為 25%的離子液體溶液，溫度30℃，考察離子液體中不同pH對酶活性的影響，結果見圖2。如圖所示，在離子液體溶液中，當pH＜7.0時，對酶活性有抑制作用，而且隨著pH的降低，抑制作用逐漸加強；相反，當pH＞7.0時，對酶活性有一定的促進作用。故實驗中為保持酶的活性，雙水相體系的pH應保持在7.0以上。

2.3 不同溫度的離子液體溶液對酶活性的影響

配制質量分數為25%的離子液體溶液，固定pH為8.0，考察不同溫度的離子液體對酶活性的影響，結果見圖3。如圖3所示，隨著溫度的升高，離子液體溶液對酶活性的抑制作用逐漸加強。[C2mim]Cl受溫度的影響相對較小，在溫度60℃時酶活性比有90%；[C6mim]Cl受溫度的影響相對較大，在溫度60℃時酶活性比只有58%；[C4mim]Cl、[C4mim]BF4、[C2mim]Br溶液在溫度 50℃時酶活性比在 90%左右，當溫度升到60℃時，酶活性比都低于80%，說明離子液體溶液在溫度較高時對酶活性影響較大。

圖3 不同溫度的離子液體溶液對酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature of ionic liquids on activity of enzyme

圖4 不同離子液體雙水相體系對分配行為的影響Fig. 4 Effect of different ionic liquid aqueous two-phase systems on partitioning behavior

2.4 離子液體雙水相體系及鹽的濃度對分配行為的影響

根據文獻[11]，選取[C4mim]BF4/NaH2PO4、[C4mim]Cl/K2HPO4、[C4mim]Br/K2HPO4雙水相體系，考察不同離子液體雙水相體系對木瓜蛋白酶分配行為的影響，結果見圖 4。結果表明，在所研究的3個體系中，[C4mim]BF4體系萃取木瓜蛋白酶的回收率偏低，NaH2PO4濃度為0.40 g·ml?1時達到最大，為65.48%，萃取木瓜蛋白酶的效果不理想，故舍去。說明離子液體種類不同，對蛋白質選擇性分離產生重要的影響，Zeng等[26]采用不同離子液體雙水相提取BSA，其萃取效果差異很大。[C4mim]Cl體系和[C4mim]Br體系的酶活性回收率和純化因子先增大后減小，在K2HPO4濃度為0.35 g·ml?1時達到最大，酶活性回收率分別為91.3%和86.55%，純化因子分別為1.48和1.49。原因是無機鹽的鹽析作用是雙水相成相的主要原因之一[27]，增大 K2HPO4的濃度，無機鹽的鹽析作用加強，木瓜蛋白酶更趨向分配于上相，但過多的鹽對木瓜蛋白酶的活性影響又較大，實驗結果與Huang等[28]用離子液體雙水相提取BSA的結果相同。相比而言，[C4mim]Cl體系的酶活性回收率比[C4mim]Br體系的酶活性回收率整體偏高，純化因子相差不多，故選取 K2HPO4濃度0.35 g·ml?1的[C4mim]Cl體系進一步優化。

2.5 離子液體側烷基鏈長度及濃度對分配行為的影響

在上述最佳條件下，考察不同側烷基鏈長度的離子液體（[Cnmim]Cl，n=2,4,6）及濃度對分配行為的影響。由圖5可知，隨著離子液體濃度的增大，[C2mim]Cl體系、[C4mim]Cl體系、[C6mim]Cl體系的酶活性回收率先增大后較小，最大分別為93.41%、92.03%、59.53%。原因是隨著離子液體濃度的增加，相比逐漸增大，木瓜蛋白酶的回收率隨之增大，繼續增大離子液體的濃度，體積排阻效應增大，導致木瓜蛋白酶在相間的傳遞以及在相中的擴散阻力大大增大，不利于蛋白質進入離子液體相，回收率下降，相同的結果在Lin等[29]使用離子液體雙水相提取BSA的研究中也可以觀察到。

在相同離子液體濃度下，[C6mim]Cl體系酶活性回收率明顯低于[C2mim]Cl和[C4mim]Cl體系。隨著離子液體側烷基鏈的增長，疏水性增強，其形成的雙水相臨界點越靠近原點，越有利于蛋白質選擇性分離，即易于分配于富含離子液體相中，分配系數增大[30]，但離子液體側烷基鏈越長，反而對酶活性影響較大，不利于酶活性的保持。相比[C2mim]Cl和[C4mim]Cl體系，最高酶活性回收率基本相同，但圖5 (b)結果顯示，[C4mim]Cl體系木瓜蛋白酶的純化因子明顯高于[C2mim]Cl體系，0.25 g·ml?1時達到最大 1.5，而[C2mim]Cl體系純化因子最高為1.37。純化因子高，表明該體系對木瓜蛋白酶的分離選擇性好，酶純度高。綜合考慮，選取0.25 g·ml?1的[C4mim]Cl體系為最佳。

圖5 不同側烷基鏈長度的離子液體及濃度對分配行為的影響Fig.5 Effect of alkyl chain length and concentration of ionic liquid on partitioning behavior

2.6 酶添加量對分配行為的影響

在上述最佳條件下，考察酶添加量對分配行為的影響。由圖6可知，酶添加量在2.2 mg·ml?1左右時，酶活性回收率最大，為94.47%；在1.8 mg·ml?1時純化因子最大，為 1.51。酶添加量在 0.20～3.0 mg·g?1時，酶活性回收率和純化因子的變化不大，說明離子液體雙水相可以提供一個比較寬的酶添加范圍，這與 Cao等[31]利用離子液體雙水相提取HRP的結果相同。隨著酶添加量的增加，相比逐漸增大，回收率相對增加，繼續增加酶量，不僅上相發生微乳化現象，增大后續分離酶的工作量，也使上相的酶容量達到飽和，導致過多的木瓜蛋白酶分配于兩相中間，使回收率下降，造成酶的浪費。綜合考慮，酶添加量為2.0 mg·ml?1比較合適，不僅酶活性回收率和純化因子較高，實驗操作和計算也方便。

圖6 酶添加量對分配行為的影響Fig.6 Effect of dosage of papain on partition behavior

圖7 pH對分配行為的影響Fig.7 Effect of pH on partitioning behavior

2.7 pH對分配行為的影響

在上述最佳條件下，考察pH對分配行為的影響，結果見圖 7。由于木瓜蛋白酶是中性蛋白，在pH 7.0左右酶活性最大，過酸或者過堿對酶活性的影響較大，為保證木瓜蛋白酶的活性不受太大影響，選取pH=5.0～11.0。由圖7所示，體系pH在5.0～7.5時，木瓜蛋白酶的酶活性回收率逐漸增大；在所選取的7個pH中，pH 8.0時，酶活性回收率和純化因子最大，分別為95.16%和1.50；pH在7.5～10.0時，木瓜蛋白酶的回收率呈下降趨勢，這與木瓜蛋白酶的等電點和電荷性質有關[32]。蛋白質是兩性電解質，離子液體雙水相體系pH的變化必然會改變蛋白質的電荷性質，從而影響到離子液體咪唑類陽離子與蛋白質之間的靜電相互作用。因此，靜電相互作用在蛋白質選擇性分離中起著重要的作用。

2.8 溫度對分配行為的影響

在上述最佳條件下，考察溫度對分配行為的影響，結果如圖8所示。溫度的變化一方面影響相物理性質的變化（例如黏度和密度等），從而影響蛋白質的分配，另一方面溫度對體系的疏水相互作用和氫鍵作用也有影響，而疏水相互作用是蛋白質在離子液體雙水相中分配的主要驅動力，氫鍵相互作用對蛋白質的分配也有重要影響[11]。在20～30℃時酶活性回收率變化不大，在 30℃時達到 93.77%，隨著溫度的繼續升高，酶活性回收率急劇下降；蛋白回收率先減小后增大，在 50℃時最小，只有32.8%。原因是，一方面在此溫度下成相物質的密度、黏度等性質發生變化，從而影響蛋白質在離子液體雙水相中的分配；另一方面，隨著溫度的升高，疏水相互作用逐漸增強，氫鍵作用逐漸減弱，在50℃時，蛋白質氨基酸殘基和水分子間的氫鍵作用遭到破壞。此時氫鍵（其他分子間）的形成受疏水相互作用的影響較少，導致疏水相互作用的效果減弱[26]。一般來說，適當提高溫度有利于蛋白質分配于富離子液體相，但在 60℃時，蛋白回收率達到53.71%，而酶活性回收率只有13.49%。根據文獻[23]可知，木瓜蛋白酶具有耐高溫的特性，60℃對活性有一定影響，但影響不是很大，而離子液體的熱穩定性非常好，咪唑類離子液體在 400℃左右才開始分解[33]，結合2.3節實驗可知，高溫（≥60℃）條件下，離子液體和木瓜蛋白酶之間存在相互作用，進而影響了木瓜蛋白酶的結構和活性。故提取木瓜蛋白酶的離子液體雙水相體系的溫度不宜太高，30℃左右為宜。

圖8 溫度對分配行為的影響Fig.8 Effect of temperature on partitioning behavior

3 結 論

木瓜蛋白酶在離子液體雙水相中選擇性分離的機理是比較復雜的。研究表明，在該體系中主要有3種作用力，即疏水相互作用、靜電相互作用和鹽析作用，蛋白酶的選擇性分配主要是這3種作用力的聯合效應，因此受到離子液體側烷基鏈長度及濃度、鹽濃度、pH、溫度等因素的影響，而疏水相互作用是蛋白酶在雙水相體系中分配的主要驅動力[11]。眾所周知，蛋白質表面存在著大量如酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基，約占總蛋白的10%左右，由于離子液體中的咪唑陽離子與木瓜蛋白酶氨基酸的苯環上均含有π-電子結構，兩者之間存在強烈的π-π堆積作用，從而使木瓜蛋白酶趨于分配于富離子液體上相中[34]。

（1）通過對酶活性穩定的考察可知，在溫度（≤30℃）較低時，離子液體對木瓜蛋白酶的活性影響較小，低濃度時還能促進酶活性；高溫（≥60℃）時，離子液體對酶活性影響較大。

（2）考察不同離子液體雙水相系統對木瓜蛋白酶分配行為的影響，可知[C4mim]Cl和[C4mim]Br體系萃取木瓜蛋白酶的效果比[C4mim]BF4體系好。

（3）通過對溫度的考察可知，高溫（≥60℃）對離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶不利。

（4）實驗優化得到[C4mim]Cl/K2HPO4離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的最佳條件為：[C4mim]Cl質量濃度 0.25 g·ml?1，K2HPO4質量濃度 0.35 g·ml?1，pH 8.0，酶添加量 2.0 mg·ml?1，30℃。此條件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率達到95.16%，純化因子 1.5，萃取結果較理想。而采用PEG/鹽雙水相系統的酶活性回收率大都在 90%以下。

（5）實驗中存在的不足在于離子液體的成本較高，對工業化大規模提取不利。今后實驗室對廉價離子液體的合成進行研究，是有實際應用價值的。

[1]Sangeetha K, Abraham T E. Chemical modification of papain for use in alkaline medium [J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006, 38 (3): 171-177

[2]Nitsawang S, Hatti-Kaul R, Kanasawud P. Purification of papain from Carica papaya latex: aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation [J].Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39 (5):1103-1107

[3]Su S N, Nie H L, Zhu L M,et al. Optimization of adsorption conditions of papain on dye affinity membrane using response surface methodology [J].Bioresource Technology, 2009, 100 (8): 2336-2340

[4]Zhang Haide (張海德), Wang Weitao (王偉濤), Jiang Xinxin (蔣欣欣). Progress on the study of mechanism and partition behavior of papain in affinity aqueous two-phase systems [J].Journal of Food Safety and Quality(食品安全質量檢測學報), 2013, 2: 4

[5]Hatti-Kaul R. Aqueous two-phase systems [J].Molecular Biotechnology, 2001, 19 (3): 269-277

[6]Li Z, Liu X, Pei Y,et al. Design of environmentally friendly ionic liquid aqueous two-phase systems for the efficient and high activity extraction of proteins [J].Green Chemistry, 2012, 14 (10): 2941-2950

[7]Freire M G, Claudio A F M, Araujo J M M,et al. Aqueous biphasic systems: a boost brought about by using ionic liquids [J].Chemical Society Reviews, 2012, 41 (14): 4966-4995

[8]Gai Q, Qu F, Zhang T,et al. Integration of carboxyl modified magnetic particles and aqueous two-phase extraction for selective separation of proteins [J].Talanta, 2011, 85 (1): 304-309

[9]Huaxi L, Zhuo L, Jingmei Y,et al. Liquid-liquid extraction process of amino acids by a new amide-based functionalized ionic liquid [J].Green Chemistry, 2012, 14 (6): 1721-1727

[10]Deive F J, Rodríguez A, Rebelo L P N,et al. Extraction of Candida antarctica lipase A from aqueous solutions using imidazolium-based ionic liquids [J].Separation and Purification Technology, 2012, 97:205-210

[11]Liu Xiaogeng (劉曉庚), Gao Mei (高梅), Chen Meimei (陳梅梅).Ionic liquids aqueous two-phase system and its research in proteins’extraction [J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association(中國糧油學報), 2013, 28 (4): 118-123

[12]Pei Y, Li L, Li Z,et al. Partitioning behavior of wastewater proteins in some ionic liquids-based aqueous two-phase systems [J].Separation Science and Technology, 2012, 47 (2): 277-283

[13]Asenjo J A, Andrews B A. Aqueous two-phase systems for protein separation: phase separation and applications [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1238: 1-10

[14]Pei Y, Li Z, Liu L,et al. Partitioning behavior of amino acids in aqueous two-phase systems formed by imidazolium ionic liquid and dipotassium hydrogen phosphate [J].Journal of Chromatography A,2012, 1231: 2-7

[15]Freire M G, Neves C M S S, Marrucho I M,et al. High-performance extraction of alkaloids using aqueous two-phase systems with ionic liquids [J].Green Chemistry, 2010, 12 (10): 1715-1718

[16]Novak U, Pohar A, Plazl I,et al. Ionic liquid-based aqueous two-phase extraction within a microchannel system [J].Separation and Purification Technology, 2012, 97: 172-178

[17]Pei Y C, Li Z Y, Liu L,et al. Selective separation of protein and saccharides by ionic liquids aqueous two-phase systems [J].Science China Chemistry, 2010, 53 (7): 1554-1560

[18]Li Z, Pei Y, Wang H,et al. Ionic liquid-based aqueous two-phase systems and their applications in green separation processes [J].TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29 (11): 1336-1346

[19]Ling Y Q, Nie H L, Su S N,et al. Optimization of affinity partitioning conditions of papain in aqueous two-phase system using response surface methodology [J].Separation and Purification Technology, 2010, 73 (3): 343-348

[20]Cao Duixi (曹對喜), Du Zheng (杜征), Han Yuting (韓玉婷),et al.Purification of papain by aqueoustwo-phase extraction [J].Acad Period Farm Prod Proces(農產品加工), 2010 (10): 21-23

[21]Li M, Su E, You P,et al. Purification andin situimmobilization of papain with aqueous two-phase system [J].PLoS ONE, 2010, 5 (12):e15168

[22]Tu Shaoyong (涂紹勇), Li Lu (李路), Yang Aihua (楊愛華),et al.Study on the extraction of papain with aqueous two-phase system [J].Science and Technology of Food Industry(食品工業科技), 2010 (9):220-222

[23]Wan Jing (萬婧). The study of extraction process of papain in papaya[D]. Haikou: Hainan University, 2010

[24]Xu Xiaodong (徐曉冬), Dan Yuanyuan (丹媛媛), Li Xinxin (李欣欣),et al. Aqueous biphasic system based on ionic liquid and its application in bioseparation [J].Biotechnology Bulletin(生物技術通報), 2008 (5): 88-91

[25]Pierce J, Suelter C H. An evaluation of the Coomassie brilliant blue G-250 dye-binding method for quantitative protein determination [J].Analytical Biochemistry, 1977, 81 (2): 478-480

[26]Zeng Q, Wang Y, Li N,et al. Extraction of proteins with ionic liquid aqueous two-phase system based on guanidine ionic liquid [J].Talanta, 2013 (116): 409-416

[27]Mehrnoush A, Sarker M Z I, Mustafa S,et al. Direct purification of pectinase from mango (Mangifera Indica cv. Chokanan)peel using a PEG/salt-based aqueous two phase system [J].Molecules, 2011, 16(10): 8419-8427

[28]Huang S, Wang Y, Zhou Y,et al. Choline-like ionic liquid-based aqueous two-phase extraction of selected proteins [J].Analytical Methods, 2013 (5): 3395-3402

[29]Lin X, Wang Y, Zeng Q,et al. Extraction and separation of protions by ionic liquid aqueous two-phase system [J].Analyst, 2013 (138):6445-6453

[30]Xia Hansong (夏寒松), Yu Jiang (余江), Hu Xuesheng (胡雪生),et al. Phase behavior of ionic liquids (Ⅱ): Aqueous two-phase [J].Journal of Chemical Industry and Engineering(China)(化工學報),2006, 57 (9): 2149-2151

[31]Cao Q, Quan L, He C,et al. Partition of horseradish peroxidase with maintained activity in aqueous biphasic system based on ionic liquid[J].Talanta, 2008 (77): 160-165

[32]Lu Y, Lu W, Wang W,et al. Thermodynamic studies of partitioning behavior of cytochrome c in ionic liquid-based aqueous two-phase system [J].Talanta, 2011, 85 (3): 1621-1626

[33]Gu Yanlong (顧彥龍), Peng Jiajian (彭家建), Qiao Kun (喬琨),et al.Room temperature ionic lliquids and their applications in catalysis and organic reactions [J].Progress in Chemistry(化學進展), 2003,15 (3): 222-241

[34]Pei Y, Wang J, Wu K,et al. Ionic liquid-based aqueous two-phase extraction of selected proteins [J].Separation and Purification Technology, 2009, 64 (3): 288-295