高效液相色譜法測(cè)定雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代謝物的殘留量

林仙軍，陸春波，包愛情，周芷錦，羅成江，李孝軍，應(yīng)永飛?

（1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311000；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山316000）

高效液相色譜法測(cè)定雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代謝物的殘留量

林仙軍1，陸春波1，包愛情1，周芷錦1，羅成江1，李孝軍2，應(yīng)永飛1?

（1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311000；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山316000）

建立了一種高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜殘留量的方法。試樣經(jīng)乙腈渦旋提取，正己烷脫脂，經(jīng)堿性氧化鋁小柱凈化，濃縮，流動(dòng)相定容，高效液相色譜分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。結(jié)果表明：該方法在0.05～5 μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。在50～500 μg／kg添加濃度范圍內(nèi)，方法回收率在70%～110%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

地克珠利；妥曲珠利；代謝物；雞肌肉；殘留量；高效液相色譜法

地克珠利和妥曲珠利是均三嗪類抗球蟲藥物，具有高效、低毒、廣譜的驅(qū)球蟲特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于畜禽球蟲病的防治［1］。妥曲珠利在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。由于這類藥物作用時(shí)間短，臨床上通常是長(zhǎng)期重復(fù)用藥，不合理用藥或未嚴(yán)格遵守休藥期等問題，容易在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，通過食物鏈傳遞，進(jìn)而危害消費(fèi)者健康。農(nóng)業(yè)部公告235號(hào)規(guī)定了地克珠利在禽肌肉中的最高殘留量為500 μg／kg，妥曲珠利在雞肌肉中的最高殘留量為100 μg／kg［2］。已有研究多以HPLC法［3-5］、毛細(xì)管電泳法［6］和LC-MS／MS法［7-9］測(cè)定動(dòng)物源食品中地克珠利、妥曲珠利及代謝物的殘留，由于這幾種藥物在紫外吸收光譜上的差異，同時(shí)分析難度較大，尚未見采用液相色譜法同時(shí)檢測(cè)雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代謝物的相關(guān)報(bào)道。本研究建立了同時(shí)檢測(cè)雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代謝物殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent1260高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）（美國(guó)安捷倫公司）；3k30型冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BuCHI公司）；MS2 minishaker旋渦混勻器（IKA公司）；AG-285電子天平（Mettler公司）；20通道固相萃取裝置（Waters公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；785DMP滴定儀（瑞士萬通公司）；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），默克公司；乙酸乙酯、正丙醇、正己烷、四氫呋喃為分析純；水為超純水；地克珠利、妥曲珠利對(duì)照品為Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，純度≥98.0%；妥曲珠利亞砜、妥曲珠利砜為WiTEGA公司產(chǎn)品，純度≥98.0%；Oasis?MAX 3CC／60MG，Waters公司；Sep-Pak?Vac 12cc（2g）（堿性氧化鋁固相萃取小柱），Waters公司。

1.2 對(duì)照溶液的配制 地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制（100 μg／mL）：稱取地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，于100 mL容量瓶中，加25 mL四氫呋喃溶解后，用乙腈稀釋至刻度，濃度為100 μg／mL。

地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 μg／mL）：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 mL，于100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為5 μg／mL，使用時(shí)根據(jù)需要吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液用流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液。

1.3 色譜條件 流動(dòng)相A為0.3%醋酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1所示。色譜柱：Agilent XDB C18，粒徑5 μm，4.6 mm×250 mm；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25℃；流速1.0 mL／min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

1.4 樣品的提取與凈化 稱取（5±0.05）g試料，于50 mL離心管中，加乙腈10 mL，旋渦混勻，中速震蕩10 min，3000 r／min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL分液漏斗中；下層殘?jiān)偌右译?0 mL重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，加20 mL正己烷萃取，靜置分層，取下層液體，過預(yù)先用10 mL 85%乙腈溶液活化的堿性氧化鋁固相萃取小柱，自然流出，收集流出液于100 mL雞心瓶中，加正丙醇5 mL，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，冷卻，殘留物用1.0 mL流動(dòng)相溶解，過0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 準(zhǔn)確吸取地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg／mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次從低濃度到高濃度進(jìn)行分析，按峰面積與對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2所示。

表2 地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)曲線表

2.2 典型色譜圖 通過樣品提取與凈化方法（1.4項(xiàng)）和色譜條件（1.3項(xiàng)），得到標(biāo)準(zhǔn)溶液、雞肌肉空白樣品和雞肌肉添加樣品色譜圖，分別如圖1、圖2、圖3所示，出峰的先后順序?yàn)橥浊槔麃嗧俊⑼浊槔俊⒌乜酥槔屯浊槔?/p>

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（0.5 μg／mL）

圖2 雞肌肉空白樣品色譜圖

圖3 雞肌肉添加樣品色譜圖（100 μg／kg）

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)溶液添加法，選取的3個(gè)添加濃度分別為50、100、500 μg／kg，符合殘留檢測(cè)的要求，其中50 μg／kg的濃度點(diǎn)大于10倍信噪比，作為定量限。每個(gè)濃度5個(gè)樣品，重復(fù)3批次，求回收率、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)。測(cè)定結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 為了確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，采用紫外分光光度法進(jìn)行紫外掃描。分別用乙腈稀釋地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜對(duì)照品溶液至約5 μg／mL，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，地克珠利在240 nm和280 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，妥曲珠利在240 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，而妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜在250 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收。綜合考慮，選擇250 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜響應(yīng)值均較多，溶劑峰對(duì)色譜峰的干擾較小。

表3 雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜及妥曲珠利亞砜的添加回收率測(cè)定結(jié)果表（n＝5）

續(xù)表

3.2 流動(dòng)相的選擇 考察了乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-醋酸溶液、甲醇-水、甲醇-磷酸溶液和甲醇-醋酸溶液等體系作為流動(dòng)相進(jìn)行分析，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相峰形較差，其余溶液作為流動(dòng)相的條件下色譜峰峰形和分離度均較好，但乙腈體系基線不易平穩(wěn)，對(duì)低濃度檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生干擾；甲醇-醋酸溶液體系色譜基線穩(wěn)定，沒有干擾，滿足檢測(cè)需要。在實(shí)際樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，試樣溶液在4種藥物峰全部出來以后還有2個(gè)較大的雜質(zhì)峰，可能會(huì)影響到下一針樣品。因此，增加梯度洗脫程序，對(duì)雜質(zhì)峰進(jìn)行洗脫，確保樣品不受之前進(jìn)樣的樣品干擾。

3.3 提取溶劑的選擇 研究了乙酸乙酯、乙腈等提取溶劑，乙酸乙酯和乙腈提取效率均較高。乙酸乙酯提取液較易旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，但脂溶性太強(qiáng)，復(fù)溶的溶液粘度大，渾濁，難以過柱，影響后續(xù)凈化，凈化后亦不能去除干擾；乙腈作為提取溶劑，能有效沉淀蛋白，方便正己烷脫脂，為后續(xù)固相萃取凈化提供方便。

3.4 固相萃取柱條件的選擇 根據(jù)查閱的資料，選擇了MAX、堿性氧化鋁等小柱作為凈化柱進(jìn)行試驗(yàn)。MAX固相萃取小柱可以凈化樣品，但是過柱程序復(fù)雜，增加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的次數(shù)，大大增加檢測(cè)時(shí)間和不確定性因素；而堿性氧化鋁小柱，過柱方式簡(jiǎn)便，回收率和凈化效果均較好。考慮到乙腈提取液中水分的含量對(duì)回收率有很大影響，因此，對(duì)乙腈提取液中的水分進(jìn)行了測(cè)定，比較了回收率和水分之間的關(guān)系。用乙腈10 mL提取5 g試料的提取液水分的含量約20%，重復(fù)提取一次，合并提取液，水分約15%。根據(jù)過柱回收率結(jié)果研究，水分在10%～30%范圍，過堿性氧化鋁，回收率均在90%左右，凈化效果對(duì)應(yīng)水分高低略有差異，提取液中水分低于10%，回收率會(huì)降低，水分高于30%，則雜質(zhì)太多，干擾檢測(cè)。用乙腈10 mL提取2次，水分含量比較合適。試驗(yàn)了不同批次的雞肌肉樣品，提取液水分均在這個(gè)范圍之內(nèi)。

4 結(jié)論

本文建立了雞肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代謝物殘留量檢測(cè)的方法。方法采用乙腈提取，提取液脫脂后直接過固相萃取小柱進(jìn)行凈化，過柱的要求低，操作簡(jiǎn)便，凈化效果和回收率較好并穩(wěn)定，能滿足檢驗(yàn)需要。該方法明顯節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間和試劑用量，有利于提高檢測(cè)效率。

［1］ 馮秀娟，劉英龍，王加才，等.廣譜抗球蟲藥-妥曲珠利［J］.中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊，2006，23（1）：29.

［2］ 中華人能共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告235號(hào).動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［3］ 施祖灝，朱良強(qiáng)，盧運(yùn)站，等.雞組織中地克珠利和妥曲珠利HPLC檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（1）：79-81，109.

［4］ 郭永剛，江善祥.妥曲珠利在肉雞組織中殘留的研究［J］.畜牧獸醫(yī)，2007，39（7）：37-39.

［5］ 楊麗萍，高淑霞，張秀玲，等.HPLC法檢測(cè)家兔血漿中地克珠利含量［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45（10）：25-27.

［6］ 施祖灝，陸俊賢，葛慶聯(lián)，等.高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)地克珠利和妥曲珠利的含量［J］.中國(guó)獸藥雜志，2008，42（9）.13-16.

［7］ 宮小明，孫軍，董靜，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中阿維菌素類、地克珠利、妥曲珠利及其代謝物殘留［J］.色譜，2011，29（3）：217-222.

［8］ Mortier L，Daeseleire E，Peteghem C V.Determination of the coccidiostat diclazuril in poultry feed and meat by liquid chroma?tography-tandem mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529：229-234.

［9］ Olejnik M，Szprengier-Juszkiewicz T，Jedziniak P.Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coc cidiostats inchickenliverusingliquidchromatographytandemmass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（46）：8141-8148.

（編輯：侯向輝）

Determination of Diclazuril，Toltrazuriland and Its Metabolites in Chicken Muscle by HPLC

LIN Xian-jun1，LU Chun-bo1，BAO Ai-qing1，ZHOU Zhi-jin1，LUO Cheng-jiang1，LI Xiao-jun2，YING Yong-fei1?
（1.Zhejiang Province Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feed，Hangzhou 311000，China；2.Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan，Zhejiang 316000，China）

A method was established for simultaneously determination of diclazuril，toltrazuril，toltrazuril sulphone and toltrazuil sulphoxide in chicken muscle by HPLC.The analytes were extracted with acetonitrile，defatted with n-hexane，and then clean up by alumina solid-phase extraction cartridges.The eluent was evaporated by nitrogen flow to dryness and dissolved the residues with mobile phase.HPLC was employed for separation and UV detector was used for detecting directly.Qualitative analysis was done by retention time and quantitative analysis by peak area respectively.The results showed that good linear relationship were obtained in the range of 0.05～5 μg／mL，with the correlation coefficients were all above 0.999.The average recoveries ranged from 70%to 110%of the spiked level at 50～500 μg／kg，and the intra-assay coefficient and the inter-assay coefficient of variation were all below 15%.The method was simple，sensitive and stable.

diclazuril；toltrazuril；metabolite；chicken muscle；residues；HPLC

2015-01-19

A

1002-1280（2015）03-0053-05

S859.84

農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂項(xiàng)目（農(nóng)財(cái)發(fā)201461（96））

林仙軍，畜牧師，從事獸藥和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)工作。

應(yīng)永飛。E-mail：yyf1001＠163.com