仿骨β相磷酸三鈣多孔生物陶瓷制備及降解

馬云海，尚文博，范雪瑩，高知輝，佟 金，閆志峰，常志勇

（吉林大學 生物與農業工程學院，長春130022）

0 引 言

生物陶瓷材料植入生物體內后極為穩定，與生物組織的親和性良好，特別適合作為人體硬組織（如骨和齒）的替換修補材料，能與骨生長在一起形成化學結合。目前生物陶瓷材料應用于骨移植的研究較多，其中對磷酸三鈣基生物陶瓷材料的研究較為廣泛，這是一種暫時性的骨替代材料，植入體內后逐漸被降解吸收，同時新骨逐漸長入以取代植入體，其中性能較好的是磷酸三鈣和羥基磷灰石。研究表明β－磷酸三鈣（以下簡稱β－TCP）的鈣磷比為1.5，接近于正常人體骨且其組成成分與骨質中的無機成分相似，具有良好的生物活性和生物相容性，在體內降解后Ca、P 元素可被直接吸收形成新骨，而多孔的β－TCP陶瓷具有大的比表面積，利于骨細胞的增殖、分化［1］。近年來多孔β－TCP 生物陶瓷一直都是國內外學者研究的熱點。

β－TCP生物陶瓷材料的制備是以β－TCP粉體作為基體，目前常用的制備β－TCP粉體的方法主要是：固相合成法和液相合成法。樊東輝等［2］利用CaHPO4·2H2O和CaCO3在高溫下的固相反應制備β－TCP粉體用于陶瓷生產，產出率高，但反應物難以混合均勻，往往伴隨反應物殘留，而且在高溫下反應時間較長，易導致粉體晶粒長大。液相合成使 用 較 廣 泛，徐 鵬 等［3］以（NH4）2HPO3和Ca（NO3）2為原料、通過氨水調節pH 值，經洗滌、干燥、灼燒后得到β－TCP粉體；何毅等［4］以Ca（OH）2和H3PO4為原料，采用中和反應法制得納米級β－TCP粉體。液相合成的方法較多，但反應過程中易產生雜質且合成工序較繁瑣，燒結后難以得到高純度的β－TCP粉體，應進一步優化改進。

為了獲得高純度β－TCP 粉體作為多孔β－TCP 生物陶瓷的基體，本文提出了以2－膦酸丁烷－1，2，4三羧酸（以下簡稱PBTC）作為磷源和Ca（NO3）2·4H2O 作為鈣源，通過凝膠后脫水縮合、高溫燒結得到純凈的β相磷酸三鈣粉體（β－TCP）的方法，并研究了以制備的β－TCP 粉體作為基體采用添加致孔劑方法制得的多孔生物陶瓷的性能。

1 β－TCP粉體制備

1.1 試驗方法及步驟

試驗中所用的硝酸鈣Ca（NO3）2·4H2O 為分析純，PBTC 為含活性組分50%的溶液，按照鈣磷原子比為1.5∶1稱量反應物，加入去離子水溶解后在磁力攪拌器上進行反應，反應溫度控制在85℃左右，在磁力棒的攪拌作用下反應3h，最后得到黃色膠狀前驅體，待膠狀前驅體在真空干燥箱中160℃下烘干后放在馬弗爐中進行高溫燒結，燒結溫度設定為1000 ℃，升溫速度為3 ℃／min，達到1000℃時保溫6h 后隨爐冷卻得到β－TCP粉體。

1.2 X射線衍射（XRD）分析

X 射線衍射儀可分析確定材料的組成成分。每種晶態物質都有其特有的結構，當X 射線通過晶體物質時，每種晶體按其化學組成和晶體結構產生固有的衍射圖紋，根據衍射峰的強度或面積，對照已知的同種物質的標準衍射圖譜可對材料的成分進行定性分析。對燒結得到的β－TCP 粉體進行X 射線衍射（XRD）分析，掃描角度2θ設定為10°～70°，掃描速度設定為10°／min。所得圖譜如圖1所示，

圖1 β－TCP粉體的XRD衍射圖譜分析Fig.1 β－TCP powder XRD diffraction pattern analysis

從圖1可以看出，制備得到的β－TCP粉體的主晶相衍射峰強度很高且十分尖銳，可知該晶體的結晶度很好，通過PDF卡片庫對比證明此晶體即為β相磷酸三鈣（β－TCP），未發現存在其他雜質峰。表明反應在該條件下進行得較徹底，產物β－TCP的結晶效果良好。研究表明，β相磷酸三鈣向α相轉變的溫度大約在1180℃，可知實驗中1000℃下燒結得到的β－TCP性質穩定，得到的粉體較為純凈，滿足后續使用要求。

1.3 粒徑分析

β－TCP粉體的粒徑大小十分重要，它對于β－TCP生物陶瓷的生物學性能及力學性能有著重要的影響。陶瓷粉體的粒徑越小，在生物體內降解效果越好，Ca、P元素被吸收重建骨骼的速度越快，利于骨修復。同時粉體粒度越細，表面活化能越大，在高溫燒結過程中顆粒更容易聚集形成致密陶瓷，提高β－TCP生物陶瓷的力學性能。通常要求的陶瓷粉體的顆粒度一般小于100μm，最好小于45μm，不大于175μm。

本試驗應用BT－9300ST 型激光粒度分布儀對燒結的β－TCP粉體顆粒進行分析，表1和表2為分析結果。由表1可以看出，粉體顆粒的粒徑分布在0.1～72.79μm 之間，粒徑區間從1.51～1.66μm 開始，區間的含量超過1%，粒徑區間為24.08～26.41μm 時的區間含量為3.48%，達到區間含量最大值，區間含量呈現遞增趨勢，之后遞減，在粒徑區間為45.91～50.34μm 時，區間含量降至1.33%，分布十分均勻。粉體顆粒的累積分布趨勢如圖2所示。

由上述試驗分析可看出，粉體顆粒中位徑為11.17μm，遠遠小于45μm，顆粒直徑到達22.99 μm 時的累積含量就達到了75%。粉體粒徑在0.10～31.75μm 區間時，隨著粉體粒徑的增加，區間含量大體上逐漸增加，粉體粒徑在31.75～72.79μm區間，隨著粉體粒徑的增大區間含量大幅降低。粉體粒徑在0.10～1.05μm 區間的β－TCP粉體占總量的3.54%，粉體粒徑在1.05～10.50μm 區間的β－TCP粉體占總量的44.63%，接近整個含量的一半，粒徑在10.50～26.41μm區間的β－TCP粉體占總量的32.18%，所占比例接近三分之一，粒徑在26.41～72.79μm 之間的β－TCP粉體占總量的19.65%，且在26.41～72.79μm 區間之內，隨著粒徑增大，所占比例減少。同時，從表1 中可以看出在12.63～45.91 μm 區間內每段的粉體含量都在3%以上，所占比例最大。制得的粉體粒徑能夠較好地滿足制備生物醫用陶瓷對粉體顆粒粒度的要求。

表1 β－TCP粉體的激光粒度分析Table 1 β－TCP powder laser particle size analysis

表2 β－TCP粉體的顆粒粒徑物理參數Table 2 Physical parameters of particle sizeβ－TCP powder

圖2 β－TCP粉體的顆粒粒徑分布曲線Fig.2 β－TCP powder particle size distribution curve

2 仿骨β－TCP多孔生物陶瓷制備

2.1 生物陶瓷成型制備

制備仿骨β－TCP 多孔生物陶瓷的方法有很多，包括添加致孔劑法、有機泡沫浸漬法、發泡法等，每種方法都有各自的優缺點［5，6］，經綜合考慮，本試驗采用添加致孔劑［7］的方法制備多孔仿骨β－TCP生物陶瓷。陶瓷制備的具體工藝流程如圖3所示

圖3 制備仿骨β－TCP生物陶瓷工藝流程Fig.3 Preparation of imitation boneβ－TCP biological ceramic process flow diagram

本試驗以前期自制的純凈β－TCP 粉體為基體，其中致孔劑和高溫粘接劑的選擇要保證成分無毒，對人體無害，且經高溫燒結后也無有害雜質殘留。綜合考慮各種材料性質后選用硬脂酸（分析純）作為致孔劑，硬脂酸為有機物、無毒性，在加熱到360℃時完全分解，留下孔隙結構；選用在高溫條件下具有較好黏和作用的聚乙烯醇（PVA）作為粘結劑。制備的多孔陶瓷試樣，其中選取β－TCP粉體、硬脂酸和聚乙烯醇的質量分數分別為60%，30%，10%。將β－TCP 粉體顆粒在研缽中研磨得到粒度均勻的粉體，硬脂酸顆粒研磨后過40目標準篩得到顆粒均勻的致孔劑。通過一定的混合方法將粉體混合均勻后裝填入圓柱形模具中，依據硬脂酸和聚乙烯醇的理化性質在熱壓機上選取40 ℃的熱壓溫度和適當的成型壓力最終得到圓柱狀陶瓷胚體，在馬弗爐中以1000℃高溫燒結，得到仿骨β－TCP多孔生物陶瓷。

2.2 燒結

根據硬脂酸以及聚乙烯醇（PVA）的理化特性對燒結溫度進行設定，前期加熱速度不宜過快，在聚乙烯醇的熔融點（200 ℃）附近應保溫一定時間，保證高溫粘結劑PVA 熔化與粉體充分接觸粘結；硬脂酸分解的溫度在380 ℃應保溫避免致孔劑分解揮發過快導致陶瓷胚體塌陷。設定的具體情況為，室溫200 ℃，加熱60 min，保溫30 min；200～250 ℃，加熱25min，保溫30min；250～380 ℃，加熱65 min，保溫30 min；380～1000℃，升溫時間207min，保溫5h，隨爐冷卻。溫度隨時間變化情況如圖4所示。

2.3 X射線衍射（XRD）分析

對燒結后的陶瓷試樣進行X 射線衍射（XRD）分析

經PDF卡片庫對比證明陶瓷燒結后的主晶相仍為β－TCP，從圖5可以看出主晶相的衍射峰很高且較尖銳、無明顯雜質峰存在。所以經過1000℃的燒結后，得到的β－TCP多孔生物陶瓷較純凈，可滿足生物材料制備的基本要求。在燒結過程中添加的致孔劑硬脂酸與粘結劑PVA 在高溫環境下分解揮發完全，無任何殘留，高溫燒結保證了制備的β－TCP多孔生物陶瓷試樣的純度。

圖4 燒結溫度隨時間變化曲線Fig.4 Sintering temperature change curve over time

圖5 燒結后生物陶瓷的XRD衍射分析Fig.5 XRD diffraction analysis after sintering bioceramics

2.4 掃描電鏡分析

使用德國蔡司的SUPRA－40 型場發射掃描電鏡對高溫燒結的β相磷酸三鈣生物陶瓷的表面形貌和內部孔徑結構進行分析。制備的多孔β－TCP生物陶瓷為非金屬材料，不導電，需要進行噴金處理，掃描結果SEM 圖像如圖6所示

經過掃描電鏡分析β－TCP 生物陶瓷樣品的表面形貌如圖6（a），看到陶瓷試樣表面較致密且存在尺寸不規則的孔洞，孔洞是致孔劑硬脂酸在高溫條件下受熱分解揮發產生的，表面層致密因模壓成型時表面層受力較大而中間層受力相對較小所致。內部孔隙結構如圖6（b）所示，在陶瓷試樣內部致孔劑硬脂酸在高溫環境中分解揮發形成孔隙的效果較好。研究表明：孔徑大于10μm 能使細胞進入孔內，15～50μm 可形成纖維組織［8］。圖6（b）顯示陶瓷內部孔隙尺寸在幾微米到幾十微米的區間內分布均勻，且孔隙之間相互連通性很好。適當的孔隙有利于細胞長入后形成組織，孔隙間相互貫通有利于毛細血管網絡的形成、便于營養成分的輸送，更有利于骨骼組織的形成和生長。同時圖6（b）中內部孔隙的效果表明陶瓷成型過程中致孔劑與β－TCP粉體混合均勻，加熱溫度、升溫速度和保溫時間的控制較合理，避免了加熱過快使硬脂酸熔化造成陶瓷試樣內部β－TCP粉體粘接團聚。生物陶瓷試樣外密內疏的結構模仿了脛骨組織外層到內層逐漸由致密骨骼轉變到網狀疏松骨骼結構，保證仿骨β－TCP多孔陶瓷材料力學性能的要求。

圖6 SEM 掃描圖像Fig.6 SEM scanning image

2.5 能譜分析

對高溫燒結的仿骨β－TCP 多孔生物陶瓷材料進行能譜分析，使用SUPRA－40場發射掃描電鏡所配備的X 射線能譜儀（EDX）對試樣進行成分分析確定元素組成，對試樣部分進行面掃描得到的掃描結果如圖7所示。

圖7 EDX成分分析Fig.7 EDX component analysis

由圖7 可以看出仿骨β－TCP 生物陶瓷含有O、P、Au以及Ca四種元素，其中Au是在進行電鏡分析試驗時為使試樣導電而對試樣表面進行噴金處理產生的，并非試樣自身含有的元素。根據圖中數據可以計算出鈣磷的原子比為1.5，符合β－磷酸三鈣的鈣磷原子比例，進一步說明制備試樣為仿骨β－TCP生物陶瓷。

3 仿骨β－TCP 生物陶瓷體外降解試驗

3.1 模擬體液配置

選用一種離子濃度與人體血漿的無機成分相近的溶液作為模擬體液（Simulated Body Fluid SBF），將試樣放入模擬人體內生物環境的溶液中通過觀察試樣的變化來評價β－TCP 的生物活性及降解性［9－10］。本試驗配置1.5SBF（1.5SBF為SBF的濃度增加到150%）溶液中［11］，配方及藥品如表3所示。

表3 模擬體液（SBF溶液）配方Table 3 Simulated body fluid（SBF）formula

3.2 降解試驗

改變致孔劑的添加量15%、20%、25%、30%得到4 組陶瓷樣品，其中每組樣品取5 個，使用AL204型電子天平對試樣進行稱重，結果精確到0.01g，按照β－TCP質量與模擬體液體積1g對應100ml的比例進行浸泡，試驗在HH－CP－01P型恒溫培養箱中進行，溫度設定為與人體體溫相近的36.8℃，每隔24h對SBF溶液進行更換，每天注意觀察變化情況。14天后，取出一部分樣品進行成分分析，28天后，再取出一部分樣品進行分析。

3.3 試驗結果與分析

試驗進行到14天，28天時分別取出每組的5個試樣，在超聲波振蕩的條件下用去離子水反復清洗后放在2K－35S型電熱真空干燥箱中設定60℃進行干燥，干燥24h后每隔半小時取出稱量質量，直到變化不明顯時證明試樣完全干燥，用AL204型電子天平稱量其質量精確到0.01g，并與降解前的質量進行對比，從而得到降解率［9］。

通過計算公式得到平均降解率，其數據如表4所示。

表4 降解14天和28天后的降解率Table 4 14and 28days，the degradation rate of degradation

由上表可以看出，4組試樣降解情況良好，前14天降解率都在3%以上，其中最高的第4組達到了5.86%，降解率較高，這應該與第4 組陶瓷的致孔劑添加量30%與其他三組相比較高有關，較多的致孔劑在燒結過程中形成的孔隙更多，在降解過程中陶瓷與SBF溶液的接觸面積大，導致降解速率更快。從表4可以看到在降解28天以后，4個組的陶瓷樣品降解率都增加一倍左右，降解穩定性良好，隨著時間的增長降解速率沒有發生突變，試樣的降解性能穩定。

圖8 SEM 掃描圖像Fig.8 SEM scanning image

對上述降解性能較好的第4組樣品進行掃描電鏡觀察分析結果如圖8所示，降解14天后的生物陶瓷的掃描電鏡圖片顯示多孔β－TCP 生物陶瓷在SBF溶液降解均勻，與降解前相比表面有顆粒狀新物質生成，生物陶瓷表面被一層新生顆粒狀物質均勻覆蓋。由于陶瓷表面的β－TCP 良好的生物相容性，溶液中的鈣磷離子逐漸沉積在β－TCP表層后形核生長，研究表明［12］表面新生成的物質是類骨羥基磷灰石。

3.4 能譜分析

對仿骨β－TCP 生物陶瓷第4 組試樣降解后的表面進行能譜分析，并分別對降解14天和降解28天的樣品進行檢測，結果如圖9所示。

圖9 能譜分析Fig.9 Energy spectrum analysis

從圖9（a）中可看出，降解14天以后，鈣磷兩種元素原子比例由降解前的1.5上升至1.57，鈣磷元素原子比的增大，證明降解過程中在生物陶瓷的表面產生了鈣磷層物質，經XRD 分析為類骨羥基磷灰石物質。羥基磷灰石是形成骨骼的主要成分，因此可以判斷在生物陶瓷降解的同時表面也有類羥基磷灰石物質的形成，體現了β－TCP陶瓷的生物活性。從圖9（b）中可以看到降解28天以后，鈣磷元素原子比例進一步上升達到1.63，更加接近羥基磷灰石的鈣磷原子比1.67，說明隨著生物陶瓷降解時間的增長，表面產生的類羥基磷灰石物質逐漸增加層疊，其成分更加接近骨骼。EDX 能譜分析與SEM 分析觀測得到的結果一致，表明了多孔β－TCP生物陶瓷在降解過程中表層生成類骨羥基磷灰石物質。

4 結 論

本研究提出以一種新的物質2－膦酸丁烷－1，2，4－三羧酸作為磷源在凝膠反應合成前驅體的基礎上高溫燒結得到較傳統液相合成方法更加純凈的微米級β相磷酸三鈣粉體，采用致孔劑法通過模壓成型高溫燒結得到β－TCP 多孔生物陶瓷。陶瓷內部孔隙尺寸在幾微米到幾十微米范圍內均勻分布，滿足細胞長入陶瓷內部的條件，孔隙間相互貫通，可使毛細血管網絡形成，利于營養物質輸送。在模擬體液SBF溶液中的降解試驗表明，多孔生物陶瓷表面有類骨羥基磷灰石物質生成。隨著生物醫學材料的進一步發展，β相磷酸三鈣基生物陶瓷材料的用途和各項性能將受到更大的關注。

［1］Bohner M，Van Lenthe G H，Grunenfelder S.Synthesis and characterization of porous β－tricalcium phosphate blocks［J］.Bio－materials，2005，26：6099－6105.

［2］樊東輝，徐政，李世普，等.多孔β－TCP 材料的生物降解性能及相關機理研究［J］.中國康復醫學雜志，2003，18（3）：166－167.Fan Dong－hui，Xu Zheng，Li Shi－pu，et al.A study on biodegradable characteristic and mechanism ofβ－TCP［J］.Chinese Journal of Rehabilitation Medicine，2003，18（3）：166－167.

［3］徐鵬，翁云飛，王欣宇.改進沉淀法合成β－磷酸三鈣［J］.中國醫藥科學，2011，1（10）：13－14.Xu Peng，Weng Yun－fei，Wang Xin－yu.Synthesis ofβ－tricalcium phosphate by modified percipitation reaction［J］.China Medicine and Pharmacy，2011，1（10）：13－14.

［4］何毅，劉孝波，楊德娟，等.納米級β－磷酸鈣的合成［J］.合成化學，2000，8（2）：96－99.He Yi，Liu Xiao－bo，Yang De－juan，et al.The synthesis of namosizedβ－tricalcium phosphate［J］.Chinese Journal of Synthetic Chemistry，2000，8（2）：96－99.

［5］鞏夢安，饒群力，王鴻烈.造孔劑與發泡法結合制備氟化羥基磷灰石多孔支架研究［J］.無機材料學報，2014，29（3）：289－293.Gong Meng－an，Rao Qun－li，Wang Hong－lie.A novel technique to prepare porous 3D fluoridared hydroxyapatite scaffold using pore－forming and hoaming agents［J］.Journal of Inorganic Materials，2014，29（3）：289－293.

［6］Legeros R Z，Lin S，Rohanizadeh R，et al.Biphasic calcium phosphate bioceramics：preparation properties and applications［J］.J Mater Sci Med，2003，14（3）：201－209.

［7］張士華，熊黨生.β－磷酸三鈣多孔生物陶瓷的制備與表征［J］.南京理工大學學報，2005，29（2）：231－235.Zhang Shi－hua，Xiong Dang－sheng.Preparation and characterization ofβ－Tricalcium phosphate porous bioceramic［J］.Journal of Nanjing University of Science and Technology，2005，29（2）：231－235.

［8］Moran J M，Pazzano D，Bonassar L J.Characterization of polylactic acid－polyglycolic acid composites for cartilage tissue engineering［J］.Tissue Eng，2003，9：63－70.

［9］Cho S B，Nakanishi K，Kokubo T，et al.Dependence of apatite formation on silica gel on its structure：effect of heat treatment［J］.Journal of the American Ceramic Society，1995，78（7）：1769－1774.

［10］林開利，常江，盧建熙，等.β－磷酸三鈣／硅酸鈣復合生物陶瓷的制備及性能研究［J］.無機材料學報，2006，21（6）：1429－1434.Lin Kai－li，Chang Jiang，Lu Jian－xi，et al.Fabrication and characterization ofβ－Ca3（P04）2／CaSi03 composite bioceramics［J］.Journal of Inorganic Materials，2006，21（6）：1429－1434.

［11］蘇葆輝，冉旭，冉均國，等.HA／β－TCP 雙相磷酸鈣陶瓷材料的生物學性能研究［J］.稀有金屬材料與工程，2007，36（A02）：37－39.Su Bao－hui，Ran Xu，Ran Jun－guo，et al.Study on biological properties of HA／β－TCP biphase calcium phosphate ceramic materials［J］.Rare Metal Materials and Engineering，2007，36（A02）：37－39.

［12］Schneider O D，Loher S，Brunner T J，et al.Cotton wool－like nanocomposite biomaterials prepared by electrospinning：In vitro bioactivity and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Mater Res，2008b，84（2）：350－362.