Streptomyces sp.（S－msu2）菌株對幾種樹木病原拮抗效應的研究

龐麗杰，王文革

（黑龍江省尚志國有林場管理局，黑龍江 哈爾濱150000）

我國每年因森林病蟲害致死樹木4 000多萬株，年均造成損失1 100多億元[1]。目前，對樹木病害的主要防治手段是采用化學農藥殺菌，而化學農藥對人畜的副作用、殘留問題及污染環(huán)境問題已成為當今世界首要解決的問題之一[2]。生物防治是植物病害防治的一種有效方法，特別是近年來利用微生物進行植物病害的防治倍受人們的高度重視，在土傳病害[3，4]、葉部病害[5，6]等的生物防治中發(fā)揮了重要的作用，并形成了多個商品化的品種，在生物農藥中占據(jù)了重要的地位。但目前在我國能夠廣泛推廣應用的生防微生物制劑種類還極為有限，在大力挖掘本土高效微生物生防菌株的同時，積極對國外優(yōu)良菌株的引進，是加快我國生物型農藥開發(fā)和應用的有效途徑。

本研究以從俄羅斯莫斯科國立大學生物系引進的Streptomycessp.（S－msu2）菌株為研究對象，通過對常見的林木植物病原真菌的抗菌試驗，測定了該菌株的抑菌譜及其發(fā)酵產物對病原菌絲的生長及孢子萌發(fā)的抑制能力，旨在為該菌株的推廣應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株：鏈霉菌Streptomycessp.，代號為S－msu2，由俄羅斯莫斯科國立大學生物系提供。

植物病原真菌：樟子松紅斑病（Dothistromapini）、楊樹爛皮病（Valsasordida）、樟子松枯梢病（Diplodiapinea）、落葉松早落病（Mycosphaerella laricileptolepis）、落 葉松枯 梢病（Botryosphaeria laricina）、落葉松芽枯病菌（Cladosporiumtenuissimum）。以上菌株由黑龍江省尚志國有林場管理局森防站保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮洗凈，稱取200g切成小塊，加水煮沸20min，用八層紗布過濾，取濾液加蒸餾水定容至1 000mL，加入20g葡萄糖、20g瓊脂，高壓滅菌（PD培養(yǎng)基內不需加入瓊脂）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌及病原菌的擴大培養(yǎng) 將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無菌條件下倒入培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿倒入約15mL，倒置過夜后，在培養(yǎng)皿中央接入生防菌和病原真菌，每種微生物接種3～4個平皿，在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，并留菌種。

1.2.2Streptomycessp.（S－msu2）菌株對林木病原菌抑制效果

（1）采用對峙培養(yǎng)法測定S－msu2對樹木病原真菌的拮抗活性。在直徑為9cm的PDA培養(yǎng)基平皿上接入直徑1cm的S－msu2和樹木病原菌菌餅，兩接種點相距3.0cm，病原菌或拮抗菌單獨接種在PDA平板上作對照，每個處理5個重復。于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測量抑菌帶的寬度。

（2）采用生長速率法測定S－msu2發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑菌作用。取活化好的S－msu2菌餅3片，接入裝有PD培養(yǎng)基300mL的500mL三角瓶中，25℃、160r·min－1振蕩培養(yǎng)7d。將培養(yǎng)液用8層紗布過濾后，濾液在50℃水浴下旋轉蒸發(fā)濃縮，以10%吐溫80定容至25mL。取濃縮液25mL與100mL 50℃PDA培養(yǎng)基混合倒平板，接種直徑1cm的病原菌菌餅，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑。以10%吐溫80作對照，每個處理5個重復。抑制效果的計算公式：

抑菌率＝（對照凈生長量－處理凈生長量）／對照凈生長量×100%。

（3）S－msu2發(fā)酵液對病原真菌孢子萌發(fā)的影響[7]。將供試病原菌孢子制備孢子懸浮液（顯微鏡100倍下100個孢子／視野）再加入S－msu2菌株的發(fā)酵濃縮液，采用載玻片上萌發(fā)法，10h后鏡檢孢子萌發(fā)情況及萌發(fā)孢子芽管的畸形情況。

孢子萌發(fā)相對抑制率＝（對照處理孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）／對照孢子萌發(fā)率×100%

1.3 分析方法

采用Excel和SPSS軟件上對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 S－msu2菌株對不同植物病原真菌拮抗譜

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，采用對峙法培養(yǎng)手段，S－msu2對實驗選用的8種植物病原真菌都有一定的拮抗能力，但S－msu2與不同病原真菌共培養(yǎng)之間的抑菌帶寬度卻存在著顯著的差異（P＜0.05）。S－msu2對樟子松枯梢病的病原真菌抑制效果較好，抑菌帶寬度達到了13.6mm，其次對B.laricina、C.tenuissimum、V.sordida病原也表現(xiàn)出了較好的抑制效果。而與D.pini之間的抑菌帶寬度最窄，只有4.5mm。S－msu2菌和各種病原真菌作為對照培養(yǎng)的平板，2個接種點之間沒有抑菌帶，菌落已經交融在一起了。

表1 S－msu2菌株對不同植物病原菌的拮抗譜

2.2 S－msu2菌株發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑菌效果

為驗證菌株S－msu2對不同植物病原菌的抑制作用是由菌株的營養(yǎng)、空間競爭的效果，還是該菌產生的細胞外抑菌物質的作用效果，進一步采用生長速率法測定S－msu2發(fā)酵液對病原菌的抑菌作用。從表2數(shù)據(jù)可以看出，S－msu2發(fā)酵液能夠對樹木不同病原菌菌絲的生長產生抑制作用，且抑菌率也存在一定的差異。對D.pinea的抑制效果最好，抑制率高達70.6%，對楊樹爛皮病的病原菌V.sordida也比較好，抑制率為66.3%，而對樟子松紅斑病D.pini的抑制效果最差，只有23.6%（表2），但仍然可以表明S－msu2菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能夠分泌細胞外抑菌物質，從而對病原菌的菌絲生長產生抑制作用。

表2 S－msu2菌株發(fā)酵液對不同植物病原菌菌絲的抑制結果

2.3 S－msu2菌株發(fā)酵液對病原真菌孢子萌發(fā)的影響

表3 S－msu2菌株對不同植物病原菌孢子萌發(fā)的結果

表3的實驗數(shù)據(jù)表明，S－msu2菌株發(fā)酵產物對供試的6種樹木病原真菌的孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，相對抑制率均超過40%，其中相對抑制率最高的是對樟子松枯梢病菌（D.pinea），相對抑制率高達75.7%，同時對楊樹爛皮病病原菌V.sordida孢子萌發(fā)相對抑制率也較高（69.6%），而對樟子松紅斑病病原菌D.pini孢子萌發(fā)相對抑制率最低，只有42.8%。通過顯微觀察，S－msu2菌株發(fā)酵產物能夠引起萌發(fā)孢子的芽管畸變，先端出現(xiàn)膨大、泡狀甚至串珠狀，即使萌發(fā)的孢子，其芽管長度也顯著小于對照。有些沒有萌發(fā)的病原菌孢子體積膨大，并出現(xiàn)空洞甚至外溢胞內原生質。

3 結論

3.1Streptomycessp.（S－msu2）菌株與供試的6種樹木病原真菌（Dothistromapini、Valsasordida、Diplodiapinea、Mycosphaerellalaricileptolepis、Botryosphaerialaricina、Cladosporiumtenuissimum）平板對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)S－msu2對6種病原真菌均有一定的抑制作用，表明其抗菌譜較寬。

3.2 菌株發(fā)酵產物能夠有效抑制6種樹木病原菌絲的生長和孢子萌發(fā)，特別是對D.pinea和V.sordida病原真菌抑制效果最為顯著。表明S－msu2菌株作為樟子松枯梢病和楊樹爛皮病的生防菌株具有一定的應用潛力。

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