豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與生物學分析

任梅滲，王 印，楊澤曉，姚學萍，林星宇

豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與生物學分析

任梅滲1,2，王 印1,2，楊澤曉1，姚學萍1，林星宇1,2

目的 從四川省某規模化養豬場病死豬肝臟分離到一株奇異變形桿菌，分析其生物學特性，為臨床鑒別診斷和治療提供參考。方法 對分離株進行革蘭氏染色、培養特性觀察、毒力試驗、生化試驗、藥敏試驗以及16S rRNA基因序列分析，并且構建系統進化樹。結果 分離株16S rRNA測序結果經BLAST對比分析，其與各株奇異變形桿菌同源性均為98%以上，將分離株與GenBank中其他6株不同來源的變形桿菌與3株不同來源的腸桿菌科細菌進行序列對比分析并且構建系統進化樹，證明分離株與豬源奇異變形桿菌(HQ259935.1)的同源性最高，為99.8%；與大腸桿菌，沙門氏菌，克雷伯氏菌的同源性僅為92.1%～93.2%。致病性試驗表明分離株對小鼠LD50為1.86×106CFU/只。分離株對氨基糖苷類和β-內酰胺類藥物中度敏感，對其他種類藥物敏感性較低。結論 分離株經鑒定為豬源奇異變形桿菌，具有較高的耐藥性和致病性。

奇異變形桿菌；豬；分離鑒定；16S rRNA

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)為條件致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌。奇異變形桿菌具有活潑的運動力，能迅速分解尿素，產生大量硫化氫，在低濃度的瓊脂表面能快速地遷徙生長，形成環狀的厚度不一的波狀菌苔[1]。奇異變形桿菌廣泛分布于泥土、水、糞便以及人與動物的體表、粘膜、消化道中；可引起人類和動物的尿道感染，引起尿道炎，腎盂腎炎，也能導致菌血癥、敗血癥[2]。研究表明該菌能夠引起豬發病并且有一定的致死性，臨床主要表現為高熱、嘔吐、腹瀉、氣喘，引起豬的敗血癥并產生不耐熱腸毒素反應而導致病豬致死[3]。近年來，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原體，在人與動物中引起的疫情頻繁發生[4]，由于近年廣譜抗生素的大量使用，其臨床耐藥菌株也開始大量產生并且其耐藥性也不斷增加，這為臨床治療帶來了更大的困難[5]。本研究針對從病死豬分離的一株細菌，根據對其進行生化鑒定，藥敏試驗，生長特性和序列分析，判定該菌為奇異變形桿菌，以此對該菌的病原學研究與臨床診斷和治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與試驗動物 從四川地區某規模化養豬場采集病死豬組織。SPF級昆明小鼠45只，體重為17～20 g，雌雄各半，購自成都達碩生物科技有限公司。

1.2 試劑與培養基 普通瓊脂、SS瓊脂、血瓊脂，麥康凱瓊脂購自奧博星生物技術(北京)有限責任公司。抗菌藥物藥敏紙片及細菌微量生化反應管均購自杭州微生物試劑有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA 分子量標準，細菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌DH5α為實驗室自行保存，其他試劑為國產分析純。

1.3 細菌分離與純化 無菌操作取病死豬肝臟接種于麥康凱瓊脂培養基，挑取光滑，圓形，半透明的單個可疑菌落涂片鏡檢并且分離純化，為后續試驗做準備。

1.4 細菌的培養特性 將分離株分別接種在瓊脂濃度為1.0%、2.0%與3.0%的普通瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h；在5%脫纖綿羊血的血瓊脂培養基和SS瓊脂培養基上劃線接種37 ℃培養24 h，觀察分離株的生長情況。

1.5 測定LD50按照改良寇氏法，用預試驗確定LD100與LD0，在此劑量區間范圍內設置5個劑量組，每個劑量組隨機取8只小鼠。每組腹腔注射不同濃度梯度的菌液0.2 mL；另取5只小鼠設置為陰性對照組并注射等量生理鹽水。每組小鼠隔離飼養，常規管理，觀察臨床癥狀并記錄死亡數，總共觀察72 h，每6 h觀察一次；剖檢死亡小鼠，記錄組織臟器的病理變化，分離致死菌進行鑒定，并以改良寇氏法[6]計算LD50。

1.6 藥敏試驗 按照藥敏紙片擴散法進行試驗，參照CLSI(2014)藥敏標準對結果進行判定[7]。

1.7 生化試驗 使用腸桿菌科細菌微量生化反應管，參照伯杰氏細菌鑒定手冊進行試驗[8]。

1.8 引物設計 采用通用引物擴增16S rRNA基因，引物序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′，預期目的片段為1 445 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.9 16S rRNA PCR擴增與序列分析 分離株DNA模板用細菌基因組DNA提取試劑盒提取。擴增體系50 μL，Rnase-free H2O 20 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL。PCR反應參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反應進行30個循環，最后72 ℃延伸10 min。使用DNA純化回收試劑盒對PCR產物進行切膠回收并連接pMD19-T載體，轉化入大腸桿菌DH5α，將重組菌液送華大科技有限公司測序。使用Blast對測序得到的基因序列與GenBank公布的各株奇異變形桿菌16S rRNA基因序列進行對比，利用MEGA4.1軟件中Neighbor-joining方法構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 生長特性與鏡下形態 從病死豬肝臟分離出1株可疑菌，編號為PLB-1，在麥康凱培養基上呈現圓形，中等大小的半透明菌落；在血瓊脂培養基上出現α溶血現象；SS瓊脂培養基上出現圓形，中等大小、扁平，中心黑色的光滑菌落(見圖1、2)。分離株在含1.0%瓊脂的普通培養基上，呈放射狀擴散生長，在含2.0%和3.0%瓊脂的普通培養基上，呈現同心圓狀擴散生長。其擴散速度在含1.0%瓊脂的普通培養基上最快，2.0%次之，在含3.0%瓊脂的普通培養基上擴散最慢(見圖3、4、5)。鏡下形態呈革蘭氏陰性菌，呈現多形性，桿狀居多，球狀偏少。

圖1 在血瓊脂上的生長特性

圖2 在SS培養基上的生長特性

圖3 1%瓊脂

圖4 2%瓊脂

圖5 3%瓊脂

2.2 LD50測定 試驗組小鼠2 h后陸續出現精神沉郁，食欲下降，被毛粗亂，6 h后部分小鼠全身震顫，眼角出血。12～30 h為小鼠死亡高峰期，48 h后不再出現死亡，對照組小鼠均未出現異常。病死小鼠肝臟和腎臟腫大，充血，伴有出血點，肝臟表面出現壞死灶，脾臟邊緣腫大充血，腸道臌氣，惡臭。取肝臟分離細菌，鑒定結果為分離株陽性。按照改良寇氏法計算LD50為1.86×106CFU/只。

表1 藥敏試驗結果

Note: “S” Sensitivity; “I” Moderate; “R” Resistance.

2.3 藥敏試驗 在測定的21種常用藥物當中，無高度敏感藥物；對6種藥物中度敏感，占總試驗藥物的28.6%，分別是諾氟沙星、新霉素、丁胺卡那、慶大霉素、頭孢噻肟以及頭孢曲松；對其他15種藥物均為耐藥，占總試驗藥物的71.4%(見表1)。

2.4 生化試驗 分離株發酵葡萄糖產酸產氣；尿素、硫化氫，明膠以及MR結果呈陽性；吲哚、VP，七葉苷試驗呈陰性；不發酵麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、衛矛醇。參照伯杰氏細菌鑒定手冊，符合奇異變形桿菌的生化特性(見表2)。

表2 生化試驗結果

Note: “⊕” positive product acid gas; “+” positive; “-” negative.

2.5 16S rRNA PCR擴增使用16S rRNA通用引物，擴增分離株16S rRNA基因序列，預計擴增片段為1 445 bp，結果符合預計的片段長度(見圖6)。

1: Product of 16S rRNA by PCR; M: DNA Marker DL2000.

2.6 16S rRNA序列同源性比較與系統進化樹的構建 16S rRNA測序所得序列已上傳GenBank(登錄號KR133627)。將其與GenBank中各株奇異變形桿菌序列進行BLAST對比分析，同源性均在98%以上。選取6株變形桿菌屬和3株腸桿菌科的不同屬的16S rRNA序列，用MEGA4.1軟件中Neighbor-jioning方法構建系統進化樹(見圖7)。分離株PLB-1與兩株豬源奇異變形桿菌HQ259935.1與AB272351.1同源性最高，為99.6%～99.8%；與AB682277.1(彭氏變形桿菌)、HF947011(普通變形桿菌)，KC210868.1(豪氏變形桿菌)同源性稍低，為98.5%～99.3%，與FJ949577.1(大腸桿菌)、FJ463825.1(沙門氏菌)，FJ655784.1(克雷伯氏菌)同源性僅為92.1%～93.2%，明顯不是同一個種屬。

圖7 分離株PLB-1 16S rRNA核苷酸系統進化樹

Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of the PLB-1 isolate

3 討 論

奇異變形桿菌屬于腸桿菌科，變形桿菌屬，是一種革蘭氏陰性的條件致病菌，能夠引發人和動物的尿道感染，引起腎盂腎炎，某些情況下也能導致菌血癥的產生。奇異變形桿菌能產生多種毒力因子，包括ZapA金屬蛋白酶，Hfq分子伴侶和溶血素等[9]。ZapA是鋅金屬蛋白酶的成員，能裂解多種底物，如IgA1，IgA2和免疫系統的防御素，而且ZapA不只是導致IgA鉸鏈部分斷裂而是能夠完全降解免疫球蛋白[10]。Hfq分子伴侶在奇異變形桿菌引起的人和動物尿路感染中是重要的影響因素，Hfq能使得其鞭毛大量表達，引起奇異變形桿菌黏附與侵襲尿路上皮細胞的能力增強，并且減少宿主體內巨噬細胞的數量，降低宿主的免疫力[11]。本試驗從病死豬肝臟分離細菌，依據培養特性、生化試驗，藥敏試驗以及16S rRNA序列分析，鑒定分離株為奇異變形桿菌。選取小鼠對分離株進行致病性試驗，測得LD50為1.86×106CFU/只。

奇異變形桿菌有很強的運動性，在瓊脂濃度低的培養基上擴散速度快，距離遠，此時其以CGC的形態生長，鏡下呈菌體較長、多鞭毛的桿菌。由于高濃度的瓊脂不利于其酸性代謝產物的擴散，繼而影響該菌的生長，所以在瓊脂濃度高的培養基上擴散速度較慢，距離較近，此時奇異變形桿菌以VC的形態生長，鏡下呈短桿菌，鞭毛減少[12]。由于奇異變形桿菌感染人和動物尿路上皮細胞的能力受到菌毛和鞭毛的影響，所以CGC的這種生長形態可能有助于提高其在尿路上皮細胞的粘附與定植能力[13-14]。本試驗將分離株分別接種在瓊脂濃度為1.0%～3.0%的普通培養基上，結果顯示分離株的擴散生長也明顯受到培養基內瓊脂濃度的影響。

有研究表明奇異變形桿菌自身攜帶的R質粒能夠在不同細菌中轉移構成復合R質粒，許多的R質粒可在異種或者異屬之間轉移，從而導致細菌的抗性進化過快，耐藥性增加[15-16]。目前多數奇異變形桿菌對β-內酰胺類與氨基糖苷類藥物敏感[1,6,14-15]，但本試驗分離株無高度敏感藥物，且僅對氨基糖苷類和β-內酰胺類的少量藥物以及恩諾沙星中度敏感，說明養殖場存在濫用抗菌藥物的情況，導致該菌可能存在多種耐藥的質粒基因，致使耐藥性較高，病原性更加突出，臨床上對于該菌的治療難度加大，所以消除耐藥質粒以及研發新型消除劑還有待更深入的研究。

近年來，人和動物感染奇異變形桿菌的報道不斷增多，在高密度養殖的飼養場內，容易迅速蔓延，引發流行病。對于該病防治與診斷技術的深入研究應引起足夠重視。

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Isolation, identification and biological characteristics analysis ofProteusmirabilisfrom swine

REN Mei-shen1,2,WANG Yin1,2,YANG Ze-xiao1,YAO Xue-ping1,LIN Xing-yu1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Chengdu611130,China)

To investigate biological characteristics and provide reference forProteusmirabilisidentification diagnosis and treatment, samples from a large scale pig farm in Sichuan Province were collected for isolation ofProteusmirabilis. The pathogen was tested by gram staining, culture characteristics observation, biochemical tests, antimicrobial susceptibility tests and 16S rRNA gene sequence analysis. Results of alignment analysis indicated that this sequence showed 98% homology with the sequence ofProteusmirabilis. Furthermore, the phylogeny tree that constructed with 6 reference strains ofProteusand 3 reference strains of enteric bacilli indicated that the highest homology with the strain HQ259935.1 was 99.8%. However, the homology with 3 strains of enteric bacilli was only 92.1%-93.2%, which proved that they didn't belong to the same species. In addition, the result of pathogenicity test showed that the LD50was 1.86×106CFU per mouse. And then, the isolated pathogen was moderately sensitive to antibiotics of aminoglycoside and β-lactam, but resistant to others. In conclusion, the pathogen was identified to beProteusmirabilis. In addition, it was proved to have strong pathogenicity and powerful drug resistance.

Proteusmirabilis; swine; isolation and identification; 16S rRNA

Wang Yin, Email: yaanwangyin@tom.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.002

王印，Email：yaanwangyin@tom.com

1.四川農業大學動物醫學院，成都 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130

R378.2

A

1002-2694(2015)12-1093-05

2015-04-28；

2015-07-25

國家“十二五”國家科技支撐計劃(No.2013BAD12B04)

Supported by the "Twelfth Five-Year-Plan" in National Science and Technology for the Rural Development in China (No. 2013BAD12B04)