皮內變態反應試驗和IFN-γ試驗在奶牛結核病檢測中的比較研究

王曲直，沈素芳，楊顯超，趙洪進，盧 軍，唐文紅，王 建，夏爐明

皮內變態反應試驗和IFN-γ試驗在奶牛結核病檢測中的比較研究

王曲直，沈素芳，楊顯超，趙洪進，盧 軍，唐文紅，王 建，夏爐明

目的 比較分析皮內變態反應試驗和IFN-γ試驗，為臨床應用提供依據。方法 對4個奶牛場的奶牛開展單純頸部皮內變態反應試驗(SICT)、比較皮內變態反應試驗(SICCT)、尾根試驗(CFT)和IFN-γ試驗的比較研究。結果 國產牛型PPD和進口牛型PPD在1 745頭試驗牛中檢出陽性符合牛19頭，兩種方法一致性高；進口牛型PPD SICT和SICCT在1 107頭試驗牛中檢出陽性符合牛5頭，兩種方法一致性中度；國產牛型PPD SICT和SICCT在1 316頭試驗牛中檢出陽性符合牛3頭，兩種方法一致性弱；SICT和CFT在599頭試驗牛中檢出陽性符合牛17頭，兩種方法一致性高；SICT和 IFN-γ試驗在236頭試驗牛中檢出陽性符合數為1頭，兩種方法一致性微弱；SICCT和 IFN-γ試驗在362頭試驗牛中檢出陽性符合牛10頭，兩種方法一致性中度。結論 應根據不同地區的結核病流行率和結核病凈化進程選擇適合的檢測方法。

皮內變態反應試驗；IFN-γ試驗；奶牛結核病

牛結核病是一種主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，該病對養牛業發展、奶產品安全與人類健康具有重大威脅[1]。中國是全球結核病高負擔國家之一，2000年第4次全國結核病流行病學抽樣調查報告顯示，結核感染率為44.5%[2]。有研究發現肺結核病人中約有15%的病人是飲用了結核病牛的奶而發病[3]。世界衛生組織在其第7次專家委員會報告中指出：在那些流行牛結核病的國家，除非撲滅牛結核病，否則人類結核病的控制是不會成功的。近年來未見全國奶牛結核病流行率的官方數據，而1985、1987年進行的2次全國奶牛抽樣調查結果，牛結核病患病率分別為5.83%和5.34%[4]。1979、1985、1990年3次全國結核病流行病學調查顯示，由牛分枝桿菌導致的結核病所占的比例分別為3.8%、4.2%、6.4%[4]。

世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties, OIE)推薦的牛結核病檢測方法有皮內變態反應試驗、γ-干擾素試驗(IFN-γ)等[1]。皮內變態反應試驗包括頸部單純皮內變態反應試驗(Single Intradermal Cervical Tuberculin, SICT)、頸部比較皮內變態反應試驗(Single Intradermal Comparative Cervical Tuberculin, SICCT)、尾根皮內變態反應試驗(Caudal Fold Test, CFT)等。目前，我國普遍采用的方法是用牛分枝桿菌提純蛋白衍生物(Purified Protein Derivative, PPD)進行SICT檢測，而 SICCT、CFT和γ-干擾素試驗在一些發達國家得到普遍應用[5-6]。本研究旨在對皮內變態反應試驗和IFN-γ試驗進行比較，為我國的奶牛結核檢疫方法積累實驗數據，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 國產牛型PPD購于哈藥集團生物疫苗有限公司。進口牛型PPD和禽型PPD購于荷蘭Prionics公司。BOVIGAM牛分枝桿菌IFN-γ檢測試劑盒購于瑞士PRIONICS公司。

1.2 試驗用牛 來自4個奶牛場，這些奶牛場每年上、下半年各進行一次結核病全群監測，對檢出的陽性牛進行撲殺和無害化處理。

1.3 皮內變態反應試驗

1.3.1 頸部皮內變態反應試驗 在頸部采用國產牛型PPD、進口牛型PPD進行二點試驗，采用國產牛型PPD、進口牛型PPD和進口禽型PPD進行三點試驗。國產牛型PPD注射于右側頸部，進口牛型PPD和進口禽型PPD注射于左側頸部。使用劑量為國產牛型PPD 2 000 IU，進口牛型PPD 3 000 IU，進口禽型PPD2 500 IU。SICT參照國標《動物結核病診斷技術(GB/T18645-2002)》進行判定，SICCT參照OIE《動物疫苗和診斷手冊》中牛結核病診斷方法進行判定[1]。

1.3.2 尾根皮內變態反應試驗 CFT參照OIE《動物疫苗和診斷手冊》中牛結核病診斷方法進行[1]，在牛尾根部位尾褶處注射0.1 mL國產牛型PPD，劑量為5 000 IU。注射后72 h手觸注射部位，如有腫脹情況，判定為陽性反應。

1.4 IFN-γ試驗 采集試驗牛抗凝血，經培養后，按照IFN-γ檢測試劑盒說明書進行牛IFN-γ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，并判定結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件對不同方法的檢測結果進行χ2檢驗；結果一致性進行Kappa檢驗：0～0.2一致性微弱；0.21～0.4一致性弱；0.41～0.6一致性中度；0.61～0.8一致性高度；0.81～1.0一致性極強[7]。

2 結 果

2.1 頸部皮內變態反應試驗

2.1.1 國產牛型PPD和進口牛型PPD SICT的比對 1 745頭試驗牛中，國產牛型PPD檢出陽性牛32頭，陽性率1.83%(32/1 745)；進口牛型PPD檢出陽性牛27頭，陽性率1.55%(27/1 745)。國產牛型PPD和進口牛型PPD的陽性牛符合數為19頭，陰性符合數1 705頭。見表1。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經Kappa檢驗，Kappa值為0.638，兩種方法一致性高。

2.1.2 進口牛型PPD SICT和SICCT的比對 1 107頭試驗牛中，進口牛型PPD SICT檢出陽性牛13頭，陽性率1.17%(13/1 107)；進口牛型PPD SICCT檢出陽性牛5頭，陽性率0.45%(5/1 107)。兩者之間的陽性符合數為5頭，陰性符合數1 094頭。見表2。如果以進口牛型PPD的SICCT為金標準，5頭陽性牛中，進口牛型PPD的SICT檢出陽性牛5頭，敏感性為100%(5/5)，1 102頭進口牛型PPD的SICCT陰性牛中，進口牛型PPD SICT檢出陰性牛1 094頭，特異性為99.27%(1 094/1 102)。結果顯示，進口牛型PPD的SICT具有很好的敏感性，陽性檢出率明顯高于SICCT，但與SICCT相比，特異性較低。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經Kappa檢驗，Kappa值為0.553，兩種方法一致性為中度。

2.1.3 國產牛型PPD SICT和SICCT的比對 1 316頭試驗牛中，國產牛型PPD SICT檢出陽性牛19頭，陽性率1.44%(19/1 316)；國產牛型PPDSICCT檢出陽性牛3頭，陽性率0.23%(3/1 316)。兩者之間的陽性符合數為3頭，陰性符合數1 297頭，見表3。如果以國產牛型PPD的SICCT為金標準，3頭陽性牛中，國產牛型PPD的SICT檢出陽性牛3頭，敏感性為100%(3/3)；1 313頭國產牛型PPD的SICCT陰性牛中，國產牛型PPD SICT檢出陰性牛1 297頭，特異性為98.78%(1 297/1 313)。結果顯示，國產牛型PPD的SICT具有很好的敏感性，陽性檢出率明顯高于SICCT，但與SICCT相比，特異性較低。該結論與進口牛型PPD的SICT和SICCT比對結果一致。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經Kappa檢驗，Kappa值為0.270，兩種方法一致性弱。

表1 國產牛型PPD和進口牛型PPD的比對試驗(單位：頭)

Tab.1 Comparative result of bovine PPD of domestic and imported

國產牛型PPDSICTDomesticbovinePPDSICT進口牛型PPDImportedbovinePPDSICT陽性Positive陰性Negative合計TotalPositive191332Negative817051713Total2717181745

表2 進口牛型PPD SICT和SICCT的比對試驗(單位：頭)

Tab.2 Comparative result of SICT and SICCT of bovine PPD of Holland

進口牛型SICImportedbovinePPDSICT進口牛型SICCTImportedbovinePPDSICCT陽性Positive陰性Negative合計TotalPositive5813Negative010941094Total511021107

2.2 CFT和SICT的比對 599頭試驗牛中，SICT檢出陽性牛32頭，陽性率5.34%(32/599)；CFT檢出陽性牛17頭，陽性率2.84%(17/599)。兩者之間的陽性符合數為17頭，陰性符合數567頭，見表4。結果顯示， SICT具更高的敏感性，陽性檢出率明顯高于CFT。在試驗中發現，CFT注射部位為尾根，常被糞便污染，不利于判定工作的開展。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經檢驗，Kappa值為0.682，兩種方法一致性高。

表3 國產牛型PPD SICT和SICCT的比對試驗(單位：頭)

Tab.3 Comparative result of SICT and SICCT of bovine PPD of China

國產牛型PPDSICTDomesticbovinePPDSICT國產牛型SICCTDomesticbovinePPDSICCT陽性Positive陰性Negative合計TotalPositive31619Negative012971297Total313131316

表4 CFT和SICT的比對試驗(單位：頭)

2.3 IFN-γ試驗

2.3.1 IFN-γ試驗和SICT比對結果 236頭試驗牛中，SICT檢出陽性牛46頭，陽性率19.49%(19/236)；IFN-γ試驗檢出陽性牛5頭，陽性率2.12%(5/236)。兩者之間的陽性符合數為1頭，陰性符合數186頭，見表5。結果顯示，IFN-γ試驗的陽性率低于SICT。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經Kappa檢驗，Kappa值為0.001，兩種方法一致性微弱。

表5 IFN-γ和SICT的比對試驗(單位：頭)

2.3.2 IFN-γ試驗和SICCT比對結果 362頭試驗牛中，SICCT檢出陽性牛24頭，陽性率6.63%(24/362)；IFN-γ試驗檢出陽性牛15頭，陽性率4.14%(15/362)。兩者之間的陽性符合數為10頭，陰性符合數333頭。見表6。結果顯示，IFN-γ試驗的陽性率略低于SICCT。結果經χ2檢驗，P<0.01。結果一致性經檢驗，Kappa值為0.487，兩種方法一致性中度。

表6 IFN-γ和SICCT的比對試驗(單位：頭)

3 討 論

參與本試驗的4個奶牛場歷年來每年開展2次SICT全群監測，對檢出的陽性牛進行撲殺和無害化處理，故試驗奶牛場的結核流行率處于較低水平。本試驗結合奶牛場的結核病集中監測開展，試驗觀察持續了2年。試驗牛涉及不同年齡段奶牛，部分奶牛因淘汰或懷孕無法全程參與所有比對試驗，故出現不同比對試驗的試驗牛總數不一致的情況，因試驗樣本量較大，并不影響試驗最后結果。本試驗采用的χ2檢驗和Kappa一致性檢驗。χ2檢驗重在檢驗兩種方法間的差異；Kappa一致性檢驗旨在評估兩種方法的一致性，無法判定哪個方法更好，但Kappa值越大，表明兩種結果可靠程度越高[8]。對同一樣本數據，這兩種檢驗可能給出矛盾的結論，主要原因是兩者對所提供的有統計學意義的結論要求非常嚴格所致。本試驗結果經χ2檢驗，6組比對試驗結果差異均有統計學意義。經Kappa一致性檢驗：國產牛型PPD和進口牛型PPD SICT、CFT和SICT兩對檢測方法一致性高；進口牛型PPD SICT和SICCT、IFN-γ試驗和SICCT兩對檢測方法一致性中度；國產牛型PPD SICT和SICCT一致性弱；IFN-γ試驗和SICT一致性微弱。

SICT存在較高的非特異性，在實際工作中，常出現采用不同廠家、不同批次牛型PPD的SICT陽性率差異較大的情況。我們對國產牛型PPD和進口牛型PPD進行SICT比對試驗，結果顯示兩者一致性高。本試驗無意于比較兩種牛型PPD的質量差異，很多因素如氣候、牛只體況、細菌或病毒感染等都會影響SICT結果。特別是非結核分枝桿菌(Nontuberculous Mycobacteria, NTM)感染，常造成假陽性的結果。在自然環境和健康牛體內中，NTM的存在比較普遍，林世平等對牛鼻腔分泌物中的NTM進行分離，分離率高達50.5%[10]，毛冉等在健康牛的頜下淋巴結和腸系膜淋巴結中分離出NTM[11]。一些研究者在STCT陽性牛的病原菌分離中發現NTM占分離株的81.5%[12]。付少剛等采用SICT的方法在1 867頭奶牛中檢出陽性牛22頭，對采集的陽性牛病料進行病原學檢測，未發現牛分枝桿菌[13]。雖然SICT特異性較差，但敏感性高，故可用于結核病流行地區的全群普檢，盡早發現陽性牛群，盡快采取控制措施。

SICCT在美國、歐盟國家得到廣泛應用[5-6，14]。我國從2013年開始，由農業部印發的《國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》規定，對SICT陽性動物，要用SICCT或IFN-γ試驗進行確診。國內有研究者將SICT和SICCT進行比較分析，證明了SICCT在不降低敏感性的同時，提高了試驗特異性[15]。我們對SICT和SICCT進行了比較分析，結果顯示進口牛型PPD SICT和SICCT一致性中度，國產牛型PPD SICT和SICCT一致性弱。總體上看，SICCT排除了禽型PPD反應陽性牛，陽性率低于SICT。在結核病已達到控制或穩定控制的低流行率地區，僅靠單一的SICT，常出現較多的非特異性干擾，不利于結核病的凈化，可以采用SICCT作為日常監測的主要手段，同時，可以引入γ-IFN試驗、細菌分離等方法作為SICCT的補充。

CFT也是OIE推薦的皮內變態反應試驗中的一種，澳大利亞等國家采用CFT進行牛結核病篩查工作[6]，該方法操作簡便，省時省力。一般認為CFT的敏感性較高，并可以通過增加PPD使用劑量，進一步提高試驗的敏感性。我們在試驗中使用5 000 IU國產牛型，發現其檢測結果和SICT的檢測結果一致性高，但敏感性低于同步開展的SICT，且尾根注射部位常被糞便污染，不利于判定工作的開展。

IFN-γ試驗作為OIE推薦的結核病檢測方法之一[1]，美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國家均利用IFN-γ試驗輔助診斷牛結核[16-17]。國內一些研究者在結核污染牛群進行IFN-γ試驗和皮內變態反應的比對，陽性符合率很高[15，18]。而我們開展試驗的奶牛場結核流行率常年處于較低水平，檢測結果顯示IFN-γ試驗和SICT的一致性弱，和SICCT的一致性中度。

我們認為，應根據不同地區結核病流行率高低選擇不同的檢測方法。高流行率地區應選擇敏感性較強的方法如SICT作為主要檢測手段，低流行率地區應選擇特異性較強的方法如SICCT作為主要檢測手段。在結核病流行地區，采用SICT對全群進行普檢，有利于盡早發現陽性牛群，盡快采取控制措施。在結核病已達到控制或穩定控制的低流行率地區，可采用SICCT排除禽型PPD反應陽性牛，減少非特異性反應。在結核病凈化地區，可在SICCT的基礎上，引入IFN-γ試驗等方法作為復核確診試驗，進一步提高檢測試驗的特異性。采用SICT、SICCT或CFT等皮內變態反應試驗，其主旨并非是診斷陽性牛個體，而是發現陽性牛群體，并采取相應的處置方法。陽性牛個體確診應平行使用皮內變態反應試驗、IFN-γ試驗、病原菌分離培養等方法。一些成功消滅牛結核病國家的經驗告訴我們，當牛群的結核病始終處于低流行率的情況下，在持續使用皮內變態反應試驗開展監測的同時，應引入分子流行病學，重視對皮試陽性牛病原菌分離以及對分離菌株從基因水平上的分離鑒定。

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Comparative study of delayed hypersensitivity test and IFN-γ test in detection of bovine tuberculosis

WANG Qu-zhi,SHEN Su-fang,YANG Xian-chao,ZHAO Hong-jin,LU Jun,TANG Wen-hong,WANG Jian,XIA Lu-ming

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China)

In order to compare the bovine tuberculosis (TB) diagnosis methods of delayed hypersensitivity test and IFN-γ test, and provide the basis for clinical application, Single Intradermal Cervical Tuberculin (SICT), Single Intradermal Comparative Cervical Tuberculin (SICCT), Caudal Fold Test (CFT) and Gamma-interferon assay (IFN-γ) were made in 4 dairy farms. Results showed that the coincidence of SICT positive cows by imported bovine PPD and domestic bovine PPD was 19 among 1 745 tested cows and the consistency was high. The coincidence of SICT and SICCT positive cows by imported bovine PPD was 5 among 1 107 tested cows and the consistency was moderate. The coincidence of SICT and SICCT positive cows by domestic bovine PPD was 3 among 1 316 tested cows and the consistency was weak. The coincidence of SICT and CFT positive cows was 17 among 599 tested cows and the consistency was high. The coincidence of SICT and IFN-γ test positive cows was 1 among 236 tested cows and the consistency was weak. The coincidence of SICCT and IFN-γ test positive cows was 10 among 362 tested cows and the consistency was moderate. The test results show that using high sensitivity test of entire herd is conducive to early detection of TB carriers and can accelerate the pace of TB control in epidemic areas. Tests with high specificity should be introduced into TB detection in control or stability control area, which can further improve the specificity of detection of TB.

delayed hypersensitivity test; IFN-γ test; bovine tuberculosis

Wang Qu-zhi, Email: shdwfy@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.015

王曲直,Email: shdwfy@163.com

上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1162-05

2015-01-25；

2015-07-24

上海市市級農口系統青年人才成長計劃[滬農青字(2014)第2-13號]和上海市科技興農推廣項目[滬農科推字(2010)第1-2號]聯合資助

Supported by the Shanghai Municipal Agricultural System Plan for Growth of Young Talents [Hu Nong Qing Zi(2014)No.2-13]; Shanghai Science and Technology Promotion Project [Hu Nong Ke Tui Zi(2010)No. 1-2]