四川省川南地區結核分枝桿菌Spoligotyping分型研究

鄧建平,劉海燦,王 斌,董海燕,張正東,趙秀芹,李 群,萬康林

四川省川南地區結核分枝桿菌Spoligotyping分型研究

鄧建平1,劉海燦2,王 斌1,董海燕2,張正東1,趙秀芹2,李 群1,萬康林2

目的 了解四川省川南地區結核分枝桿菌基因型構成情況，為結核病防控提供分子流行病學依據。方法 采用間隔區寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)方法對四川省川南地區267株臨床分離菌株進行基因分型，結果采用BioNumerics(Version 5.10)軟件進行分析，并將Spoligotyping分型結果與SpolDB4.0數據庫中的菌株進行比對分析。結果 267株結核分枝桿菌表現出66種基因型，其中51株表現為獨特基因型，其余216株可聚為10個基因簇。與SpolDB4數據庫比對分析發現，267株結核分枝桿菌中，144株為北京家族菌株(53.93%)，79株為T家族菌株(29.59%)，9株為H家族菌株，3株為U家族菌株，2株為MANU家族菌株，其余30株表現的基因型為數據庫中不存在的基因型。結論 四川省川南地區結核分枝桿菌存在較高的基因多態性，北京家族菌株和T家族菌株為主要的流行菌株，應加強對這兩類菌株的流行趨勢的監測及生物學特性研究。

結核分枝桿菌；間隔區寡核苷酸分型；北京家族

基因分型技術是結核分枝桿菌分子流行病學研究中的重要方法，在追蹤結核病的暴發流行、預測結核病的傳播模式，以及研究結核分枝桿菌菌株之間的遺傳學關系等方面具有重要的作用。Kamerbeek等提供的分析結核分枝桿菌DR區的寡核苷酸序列的分型方法(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)，是一種以PCR為基礎的快速分型方法[1-2]，該方法簡便，快速，能夠同時對結核分枝桿菌進行檢測和分型，并且數字化的實驗結果能夠方便的在不同實驗室間進行結果比較，是目前應用最廣泛的結核分枝桿菌基因分型方法。

本研究對在四川省川南地區收集的267株結核分枝桿菌臨床菌株進行了Spoligotyping分型研究，以初步了解該地區結核分枝桿菌的基因型構成以及主要流行菌株的流行程度，為該地區結核病的防治工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 本研究中的267株結核分枝桿菌臨床分離菌株，由四川省自貢市疾病預防控制中心結核病防治所提供。結核分枝桿菌實驗室標準菌株H37Rv和BCG購自中國食品藥品檢定研究院，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳代培養。

1.2 主要試劑與儀器 2×Taq MasterMix( 北京康為世紀生物科技有限公司)、Biodyne C膜(Pall Biosupport公司)、streptavidin-peroxidase conjugate和CDP-star檢測液(Amersham公司)。雜交儀(MN45，Immunetics公司)、生物安全柜、PCR儀、雜交爐等儀器由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.3 基因組DNA制備 取一菌環L-J培養基上生長良好的菌落，重懸于含有300 μL TE溶液的螺口管中，放入沸水浴中15 min，再12 000 r/min離心3 min；取上清液即為后續PCR過程使用的模板DNA，放-20 ℃保存備用。

1.4 Spoligotyping 參照Kamerbeek等研究中推薦使用的Spoligotyping 基因分型標準操作方法，對本研究中收集的267株結核分枝桿菌臨床菌株進行分型操作[2]。實驗過程中以H37Rv和BCG的基因組DNA作為陽性對照物，蒸餾水作為陰性對照物。

1.5 數據分析 將實驗結果轉換為數字化結果并錄入Excel表，其中雜交結果陽性用“1”表示，陰性用“0”表示[3]。并將所有菌株的Spoligotyping 結果與SpolDB4.0數據庫[4]進行比對分析確定菌株的Spoligotyping類型，再采用BioNumerics(Version 5.10)軟件依據Spoligotyping結果用UPGMA方法對菌株進行聚類分析[5]。

2 結 果

2.1 菌株多態性分析 根據Spoligotyping分型結果，本研究收集的267株結核分枝桿菌臨床分離菌株表現出66種Spoligotyping基因型(圖1)， 其中51株結核菌株表現為獨特的Spoligotyping基因型，其余的216株結核菌株可聚為10個基因簇(2～128株/簇)，菌株成簇率為77.15%。

從左至右為(1)UPGMA聚類樹，(2) Spoligotyping 指紋圖譜(3)對應基因型的菌株數量

From left to right: 1) UPGMA dendrogram generated by Spoligotyping patterns. 2) Spoligotyping patterns. 3) Strains numbers.

圖1 267株結核分枝桿菌Spoligotyping分型結果聚類圖

Fig.1 Spoligotypes of the 267M.tuberculosisstrains.

2.2 Spoligotpying分型結果 將本研究中的267株結核分枝桿菌的Spoligotyping分型結果與SpolDB4.0數據庫中的數據進行比對分析后發現，共有144株結核分枝桿菌臨床分離菌株被鑒定為北京家族(Spoligotyping分型結果中1～34間隔區缺失，35～43九個間隔區中有3個或3個以上間隔區存在)，占全部菌株的53.93%。另外，有79株被鑒定為T家族，9株為H家族，3株為U家族，2株為MANU家族，其余30株結核菌株的Spoligotyping基因型在比對數據庫中不存在，為本研究中特異性的Spoligotyping分型結果。

3 討 論

結核分枝桿菌Spoligotyping分型方法是目前應用最廣泛的分子分型方法之一[6-7]，并且國際上已經建立了基于Spoligotyping的基因分型數據庫(SpolDB4.0)[4]。目前，該數據庫共包含了來自全球141個國家和地區的39 295株結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)菌株的Spoligotyping分型數據，可以通過將某地區獲得的Spoligotyping分型結果與該數據庫中的數據比對分析，進行樣品菌株的分型鑒定工作；同時，也可以提示地區局部的菌株流行特征。既往的結核分枝桿菌的分子流行病學研究結果顯示，目前全球范圍內的結核病流行，主要是由幾種特殊的結核分枝桿菌基因家族菌株引起的，如北京家族，T家族，H家族，CAS家族，EAI家族以及其它局部地區流行的菌株家族等。不同的基因家族菌株，具有不同的分子特征、地區性分布以及致病性，甚至在藥物敏感性方面也具有較大差異[8-10]。北京家族菌株在不同的研究報告中被發現分布廣泛，并被認為可能具有更強的致病能力，約占全世界臨床分離菌株的13%，在亞洲遠東地區更是高達50%左右[4, 11]。我國部分省、市、自治區對結核分枝桿菌北京家族基因型也進行了深入的研究，發現結核分枝桿菌北京家族菌株為我國主要流行的菌株，且總體上北方省份北京家族菌株所占的比例要高于南方省份，特別是在黃河以北部分省區分離菌株中的最高占比更是可達80%以上[12-17]。另外，既往研究發現結核分枝桿菌北京家族基因可能具有更強的傳播能力和毒力，并可能與耐藥性結核病存在關聯[18]。因此研究不同地區主要流行的結核分枝桿菌的基因型構成，特別是北京基因型菌株的流行狀況，對當地結核病的分子流行病學監測和結核病防治工作都具有重要的意義。

本研究對從四川省川南地區分離收集的267株結核分枝桿菌進行了Spoligotyping基因分型研究。通過研究發現在267株結核分枝桿菌中，北京家族菌株占全部菌株的53.93%，與既往研究結果一致，即北京家族菌株仍為該地區的主要流行菌株，但卻顯著低于相鄰的西藏地區(約90%)，這可能與兩地人口構成差異等有關。結核分枝桿菌T家族菌株在本地區是流行程度僅次于北京家族菌株的一類菌株，既往的研究發現結核分枝桿菌T家族菌株為歐美的主要流行菌株，但近年在我國其它地區進行的研究中也發現了T家族菌株的流行，此家族菌株流行的具體原因仍然需要更深入的研究。此外本研究中還發現H家族、U家族和MANU家族菌株，及其它未在SpolDB4.0數據庫中收錄Spoligotyping類型的菌株，可以發現本次研究中的菌株表現出一定的多態性。但是，由于Spoligotyping分型數據不能對北京家族菌株之間進行有效的區分，需要引入更精確的分型方法進行研究，以便進行病例追蹤、復發調查等研究工作。

總之，本研究對四川省川南地區結核分枝桿菌的基因型構成及主要流行菌株的流行情況進行了初步描述，發現北京家族菌株和T家族菌株為川南地區的主要流行菌株，在結核病的分子流行病學監測中應當加強對這兩類基因家族菌株的監測，對四川省川南地區結核病的流行趨勢分析具有重要意義。

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Spoligotyping ofMycobacteriumtuberculosisin the South of Sichuan Province

DENG Jian-ping1,LIU Hai-can2,WANG Bin1,DONG Hai-yan2,ZHANG Zheng-dong1,ZHAO Xiu-qin2,LI Qun1,WAN Kang-lin2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesPreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the distribution of genotypes ofMycobacterium(M.)tuberculosisin the South of Sichuan Province. And furtherly, to provide the basis on molecular epidemiology for tuberculosis (TB) prevention and control. In the year of 2010, 267 clinical isolates were genotyped by using spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) in the South of Sichuan. After that, BioNumerics (Version 5.10) software was used to analysis the results and then compared them to the SpolDB4 database. Of the 267M.tuberculosisisolates, there were 66 genotypes. Of which 51 strains showed unique genotypes, and the remaining 216 strains were grouped into 10 gene clusters. By comparing with the SpolDB4.0 database,we found that 144 strains belonged to the Beijing family (53.93%), 79 strains were the T family (29.59%), nine H-family strains, three U-family strains, two MANU-family strains, the other 30 strains showed strange genotype that didn't exist in the SpolDB4.0 database. In the South of Sichuan,M.tuberculosishas high gene polymorphism, Beijing family and T family strains are the main epidemic strains. It’s necessary to strengthen the monitoring and biological characteristics research of the two genotypes strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Spoligotyping; Beijing family

Wan Kang-lin,Email:wankanglin@icdc.cn; Li Qun, Email:lqzgcdc@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.006

萬康林，Email:wankanglin@icdc.cn; 李群，Email:lqzgcdc@163.com

1．四川省自貢市疾病預防控制中心，自貢 643000； 2.傳染病預防控制國家重點實驗室，感染性疾病診治協同創新中心，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1116-04

2015-07-30；

2015-11-17

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”國家科技重大專項“十二五”課題(No.2013ZX10003006-002)。(鄧建平和劉海燦為同等貢獻)

Supported by the project of Chinese National Key Program of Mega Infectious Disease(No.2013ZX10003006-002)(Deng Jian-ping and Liu Hai-can contributed equally to this work).