一種高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立與應用

朱 濤,段 芹,李朝品,瞿 滌

一種高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立與應用

朱 濤1,段 芹2,李朝品1,瞿 滌3

目的 建立一種高效構建葡萄球菌基因敲除突變株的方法。方法 通過融合PCR將vraSR操縱子上、下游同源片段連接起來；通過基于位點特異性重組的Gateway克隆技術將融合PCR產物連接入溫度敏感型穿梭質粒pKOR1，轉化修飾缺陷型大腸桿菌DC10B，獲得同源重組質粒pKOR1-vraSR；電轉化表皮葡萄球菌RP62A株；在高溫和氯霉素雙重選擇壓力下，質粒通過第1次同源重組整合到表皮葡萄球菌染色體上；轉移到無抗生素的培養基中繼續培養，發生第2次同源重組；將菌液涂布于含1 μg/mL脫水四環素的培養基上進行反向篩選，那些未發生重組的整合菌株因表達必需基因secY的反義RNA而無法生存，最后，挑取菌落通過PCR進行鑒定。結果 成功構建了難以轉化的表皮葡萄球菌RP62A株的vraSR基因敲除突變株。結論 利用大腸桿菌DC10B和穿梭質粒pKOR1對葡萄球菌進行基因敲除的方法簡便高效，適用的范圍更廣泛。

基因敲除；葡萄球菌；反向選擇；限制修飾系統

Supported by the Open Research Fund Program of Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Ministry of Education and Health(No.201406),the Research Fund of Anhui Province Key Laboratory of Biological Macro-molecules Research (No.LAB201408),the Key Program of Educational Commission of Anhui Province of China (No .KJ2015A218), and the Provincial Training Program of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates (No.AH201310368111) Corresponding author: Li Chao-pin, Email: cpli001@163.com

應用遺傳操作鑒定病原菌毒力因子的原則被Stanley Falkow稱為分子郭霍法則。基本的前提是通過精確的遺傳操作，使編碼潛在毒力因子的基因失活[1]。基因敲除是實現基因失活的重要手段之一。現階段葡萄球菌基因敲除的基本策略是將目的基因上游片段、抗生素抗性基因、下游片段分別連接入大腸桿菌/葡萄球菌穿梭質粒構建同源重組質粒；然后導入限制性缺陷的金黃色葡萄球菌RN4220中進行修飾，最后導入目標菌株；在溫度和抗生素的雙重選擇壓力下，重組質粒與染色體發生兩次單交換，抗生素抗性基因取代目的基因，突變株最終通過其對抗生素的抗性而被篩選出來[2-3]。

然而，由于同源重組以及質粒丟失的幾率都很低，因此突變株的篩選就成為了一項費時費力的工作。而pKOR1質粒則通過引入反向選擇改進了突變株的篩選工作。該質粒在誘導條件下可表達secY基因的反義RNA，secY是葡萄球菌的必需基因，攜帶或整合了該質粒的菌株在篩選時將無法生存，因此極大地提高了篩選的效率。另外，由于在質粒中引入了重組位點，因此可運用Gateway克隆技術快速構建同源重組質粒[4]。此外，由于葡萄球菌存在強大的限制修飾系統，因此對其基因敲除只能集中在少數可轉化的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌實驗室菌株上。近年來研究發現IV型限制修飾系統是阻止質粒DNA從大腸桿菌轉移至葡萄球菌的主要屏障。IV型限制性內切酶識別胞嘧啶甲基化的DNA序列[5]。Monk等人建立了大腸桿菌克隆菌株DH10B的dcm突變株DC10B，發現分離自DC10B的質粒DNA能夠直接轉化金黃色葡萄球菌的大多數克隆復合體和表皮葡萄球菌[6-7]。

因此，本研究擬采用大腸桿菌DC10B和穿梭質粒pKOR1構建一株難以轉化的表皮葡萄球菌的vraSR基因敲除突變株，vraSR基因編碼的雙組分調節系統在葡萄球菌的耐藥性調控方面發揮著重要作用[8]，以期建立一種高效的葡萄球菌基因敲除的新方法，為后續的基因功能研究提供強有力的技術支撐。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒 表皮葡萄球菌35 984株由本實驗室保存，大腸桿菌DC10B由復旦大學許濤博士惠贈，穿梭質粒pKOR1由復旦大學丁百興博士惠贈。

1.2 主要試劑和培養基 溶葡萄球菌素(Lysostaphin)、氯霉素、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；脫水四環素為中國藥品生物制品檢定所產品；細菌基因組提取試劑盒、2×Pfu PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；BP ClonaseTMII Enzyme Mix購自Invitrogen公司；質粒提取試劑盒購自Qiagen公司；引物合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TSB( Tryptic Soy Broth) 為美國BD公司產品；B2培養基成分為：10 g/L干酪素水解物，25 g/L酵母提取物，25 g /L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀，5 g/L葡萄糖。

1.3 表皮葡萄球菌基因組DNA的提取 將過夜培養的表皮葡萄球菌RP62A株按1∶100接種于4 mL TSB培養基中，37 ℃振蕩培養4～5 h，取1 mL菌液12 000 g離心收集菌體，重懸于180 μL TE緩沖液，加入20 μL溶葡萄球菌素溶液(1 mg/mL)，37 ℃孵育30 min以使菌體充分裂解(以澄清透明為準)。后續實驗依照試劑盒使用說明書進行，最后基因組DNA溶解于60 μL超純水中(pH7.0)。

1.4vraSR基因上下游同源片段的擴增及融合PCR反應 基因敲除突變株的構建流程和基本原理如圖1所示。以表皮葡萄球菌基因組DNA為模板，以引物vraSR-UF和vraSR-UR擴增上游同源片段，以引物vraSR-DF和vraSR-DR擴增下游同源片段，切膠回收。具體引物序列見表1，小寫字母為上下游同源片段之間的互補序列，下劃線為attB1和attB2位點。參照李敏等人的文獻[9]，在50 μL的體系中加入等摩爾的上下游同源片段共3 μL(DNA總質量約600 ng)，2×Pfu PCR MasterMix 25 μL，超純水18 μL進行互補延伸，以形成全長的融合PCR產物(中間產物)。反應條件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，10 cycles；72 ℃ 10 min。在上述中間產物中加入引物vraSR-UF和vraSR-DR各2 μL，依照下列反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 2 min，30 cycles；72 ℃ 7 min進行融合片段的全長擴增。

1.5 同源重組質粒pKOR1-vraSR的構建Gateway克隆 取融合PCR產物4 μL(約300 ng)，pKOR1質粒1 μL(約150 ng)，TE緩沖液3 μL，BP ClonaseTMII Enzyme Mix 2 μL，混和均勻后置于25 ℃孵育18 h。加入1 μL 2 μg/μL蛋白酶K，置于37 ℃ 孵育10 min以停止BP 反應。將上述BP 反應產物轉化大腸桿菌DC10B感受態細胞，轉化后的全部菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜。從LB平板上挑取5個菌落進行質粒小量提取并對獲得的質粒進行PCR擴增驗證。PCR反應條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 cycles；72 ℃ 7min。

表1 用于基因敲除突變株構建和驗證的PCR引物

1.6 表皮葡萄球菌感受態制備及電轉化實驗 取對數生長早期的表皮葡萄球菌6 mL，1/2體積的超純水洗滌2次，1/5和1/10體積的10%甘油各洗滌一次，最后重懸于80 μL 10%甘油，即得感受態細胞。向感受態細胞中加入中量提取的重組質粒10 μg，混合均勻后轉移至1 mm間隙的電擊杯中進行電擊。電轉條件：電壓2.1 kV，電容25 μF ，電阻100 Ω。立即加入800 μL B2培養基，30 ℃振蕩培養3 h。全部菌液涂布至含10 μg/mL氯霉素的TSB平板上，30 ℃溫箱培養48 h。

1.7 基因敲除突變株的篩選與鑒定 挑取PCR鑒定正確的單菌落接種至3 mL 含10 μg/mL氯霉素的TSB培養基(TSBCm10)，30 ℃培養過夜。將菌液1∶100稀釋到50 mLTSBCm10培養基中，42 ℃培養過夜。將菌液1∶100 稀釋到50 mL TSBCm5培養基中，42 ℃培養過夜。菌液稀釋涂布至TSBCm10平板上，42 ℃培養過夜。挑取單個菌落接種至5 mL TSB中，30 ℃培養過夜以促進質粒丟失。將菌液104倍稀釋涂布至含1 μg/mL脫水四環素(ATc)的TSB平板上，37 ℃培養24 h。挑取50個菌落分別接種普通TSB平板和TSBCm10平板，37 ℃培養過夜。選擇10個僅在TSB平板上生長的菌落進行基因組DNA提取，以上游同源片段外側的引物vraSR-IF和下游同源片段外側的引物vraSR-IR進行PCR擴增(如圖1所示)，并以野生株基因組作為對照，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min 30 s，30 cycles；72 ℃ 7 min。若能擴增出目的大小的DNA片段，則說明vraSR基因已被成功敲除。

2 結 果

2.1 同源區域融合片段的獲得 如圖2所示，以表皮葡萄球菌RP62A株基因組DNA為模板，通過PCR擴增分別獲得了1 049 bp和852 bp大小的vraSR基因上、下游同源片段，進一步通過融合PCR反應將兩段連接起來，獲得了1 901 bp大小的融合產物。

UF: upstream fragment; DF: downstream fragment.

Fig.1 Schematic chart for the construction of thevraSRknockout mutant

UF: upstream fragment, DF: downstream fragment, UD: upstream + downstream

圖2vraSR操縱子上、下游同源片段的融合PCR反應

Fig.2 Fusion PCR product of fragments upstream and downstream of thevraSRoperon

2.2 同源重組質粒pKOR1-vraSR的鑒定 采用引物vraSR-UF和vraSR-DR對挑取的5個轉化后的DC10B菌落提取質粒進行PCR擴增，結果顯示從5個菌落均擴增出了長度為1 901 bp的特異性DNA片段(圖2)，表明通過Gateway克隆技術成功構建了同源重組質粒pKOR1-vraSR。

M: D2 000 marker; Lanes 1-5: five transformants.

2.3 表皮葡萄球菌vraSR基因突變株的鑒定 以上、下同源片段外側區域設計的引物vraSR-IF和vraSR-IR，對挑選的10個可在脫水四環素誘導條件下生長、在含氯霉素培養基上不能生長的菌落和野生株分別提取基因組DNA進行PCR擴增，結果顯示3、4、7、8、9號菌落的PCR產物長度與野生株的一致，在3.5 kb左右，而1、2、5、6、10號菌落的PCR產物長度不到2.5 kb(圖3)，表明1、2、5、6、10號菌落的vraSR基因被成功敲除。

M: 1 kb DNA marker; Lanes 1-10: ten colonies picked from TSB agar containing ATc; wt: wild type strain.

圖4 表皮葡萄球菌vraSR基因突變株的PCR篩選鑒定

Fig.4 PCR screening forvraSRknockout mutants ofS.epidermidis

3 討 論

CA-MRSA的出現以及表皮葡萄球菌醫院分離株耐甲氧西林的高發生率，亟須我們在基因水平上更好地理解這些醫學重要葡萄球菌[10-11]。然而，由于無法對大多數的臨床分離株進行包括基因敲除在內的遺傳操作，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的功能基因組研究受到了很大的限制。現階段對金黃色葡萄球菌的功能研究主要通過突變實驗室菌株Newman、8325-4，以及近年來通過突變一些社區獲得性耐甲氧西林USA300菌株來進行。而對于表皮葡萄球菌，可轉化的菌株1457和O-47是遺傳研究的主體，但是這些菌株的基因組目前尚未被測定[7]。本研究利用Gateway克隆技術構建同源重組質粒，經大腸桿菌DC10B擴增后成功轉化了過去難以轉化的表皮葡萄球菌RP62A株，通過反向選擇成功篩選出了表皮葡萄球菌vraSR突變株，建立了一種強大的可在葡萄球菌實驗室菌株和先前無法被轉化的菌株上通過同源重組構建突變株的方法。

該方法簡便快捷，適用范圍廣泛，首先體現在同源重組質粒的構建方面，基于位點特異性重組的Gateway技術，相較于傳統的克隆構建省去了酶切連接的步驟。其次，同源重組質粒經DC10B擴增后無須經過金黃色葡萄球菌RN4220的修飾便可直接轉化目標菌株，不僅簡化了實驗步驟和節約了時間和試劑成本，因為從RN4220中提取質粒不但需要昂貴的溶葡萄球菌酶，而且往往由于裂解效率低導致質粒的濃度和純度都不高，還克服了經RN4220修飾的質粒僅能轉化一小部分親緣關系較近的金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌分離株的不足。大腸桿菌DC10B的建立與應用使得之前難以對其進行遺傳操作的葡萄球菌的研究工作能夠得以開展。最后，反向選擇技術的應用既能提高篩選的效率，又能獲得無抗生素標記的突變株。本研究中作者挑取了50個菌落進行篩選，最后鑒定到5個菌落的基因被成功敲除，突變株的獲得率不低于10%；而作者曾經使用pBT2穿梭質粒構建雙組分調節系統基因lytSR和arlSR的突變株，需要挑取200～400個菌落，突變株的獲得率通常不足1%[12]。穿梭質粒pMAD雖然通過引入藍白斑篩選很大程度上提高了篩選效率，但由于需要利用抗生素抗性作為篩選標記，因此會在突變株中引入外源基因。

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Establishment and application of a rapid and efficient method for gene replacement inStaphylococci

ZHU Tao1,DUAN Qin2,LI Chao-pin1,QU Di3

(1.DepartmentofMedicalParasitology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China;2.DepartmentofStomatology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China; 3.KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,MinistryofEducationandHealth,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

We established a rapid and efficient method for creating knockout mutants inStaphylococci. The upstream and downstream homologous regions of thevraSRoperon were combined by fusion PCR, ligated into temperature-sensitive shuttle plasmid pKOR1 by the Gateway cloning technology, and then transformed into a restriction-defectiveE.colistrain DC10B, yielding the recombinant plasmid pKOR1-vraSR. The plasmid was then electroporated intoStaphylococcusepidermidisRP62A strain. Under the selective pressure of high temperature and chloramphenicol, the plasmid was firstly integrated into the chromosome ofS.epidermidisthrough a single crossover event. The integrant strain was then subcultured, and the second crossover occurred subsequently in the absence of antibiotic selection, resulting in either wild-type strain or the mutant, which depended upon where the recombination event occurred. Finally, the culture was plated on the medium containing 1 μg/mL anhydrotetracycline for counter selection, several colonies were picked up and analyzed by PCR to identify the mutant. Result showed that avraSRknockout mutant of the untransformableS.epidermidisRP62A was successfully generated in this study. In conclusion, the method for gene replacement inStaphylococciby usingE.coliDC10B and shuttle plasmid pKOR1 is simple and efficient.

gene knockout;Staphylococci; counter selection; restriction modification system

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.003

李朝品,Email:cpli001@163.com

1.皖南醫學院醫學寄生蟲學教研室，蕪湖 241002； 2.皖南醫學院口腔醫學院，蕪湖 241002； 3.復旦大學教育部/衛生部醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

R378.1

A

1002-2694(2015)12-1098-05

2015-04-15；

2015-07-09

教育部醫學分子病毒學重點實驗室開放課題(No.201406)，安徽省重點實驗室自助研究課題(No.LAB201408),安徽省教育廳自然科學研究重點項目(No.KJ2015A218),省級大學生創新創業訓練計劃(No.AH201310368111)