豬偽狂犬病毒Jiangxi-FZ株的分離鑒定及其重要毒力基因分子特征

范克偉，戴愛玲，吳德峰，林煒明，盧馬英，楊小燕

豬偽狂犬病毒Jiangxi-FZ株的分離鑒定及其重要毒力基因分子特征

范克偉1,2，戴愛玲1,2，吳德峰3，林煒明1,2，盧馬英1，楊小燕1,2

目的 研究偽狂犬病病毒(PRV)新流行毒株重要毒力基因的分子特征。方法 本研究從江西省某規(guī)模化豬場疑似豬偽狂犬病發(fā)病仔豬的腦組織中分離到1株病毒，通過PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)、細胞免疫熒光及易感動物試驗證實該病毒為PRV野毒株并命名為PRV Jiangxi-FZ株。并對其重要毒力基因TK、gB、gC、gD及gE的分子特征和遺傳進化關系進行分析。結果 Jiangxi-FZ株與其他PRV參考毒株的TK、gB、gC、gD及gE基因在核苷酸和氨基酸水平均具有很高的保守性，尤其是與2012年分離的2株PRV變異株的同源性較高。但在高度保守的基礎上，仍存在一些差異，且部分差異具有特征性。遺傳進化樹分析結果顯示，PRV Jiangxi-FZ株與2012年國內不同省份分離的PRV變異株親緣關系較近，而與Becker等歐美洲毒株親緣關系相對較遠。結論 Jiangxi-FZ株具有當前PRV流行毒株的代表性，屬近年來流行的PRV變異毒株。

偽狂犬病病毒；分離鑒定；毒力基因；分子特征

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一種急性傳染病，以新生仔豬的腹瀉及神經癥狀，妊娠母豬繁殖障礙、流產、死胎及呼吸道癥狀，成年豬隱形感染，長期帶毒排毒為特征[1]。在中國，豬偽狂犬病的流行范圍很廣，給養(yǎng)豬業(yè)造成的經濟損失僅次于豬瘟[2-3]。PRV屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA，全長約150 kb，基因組G+C含量最高達73%，至少含有70個基因，編碼約100種蛋白質，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質[2]。PRV毒力由幾種基因協(xié)同控制，其中TK基因編碼的胸苷激酶參與病毒的復制和潛伏感染，對病毒在宿主中樞神經系統(tǒng)中的復制起重要作用，TK基因一旦滅活，則病毒毒力喪失或明顯降低[4-6]。gB基因編碼的糖蛋白參與病毒在細胞間的傳播，促進病毒的細胞融合過程，并誘導機體產生中和抗體[7-8]。糖蛋白gC作為PRV最主要的保護性抗原之一，能誘導細胞免疫，產生中和抗體，參與補體系統(tǒng)的激活。另外，gC參與病毒吸附、釋放，對病毒毒力也起著十分重要的作用[9-11]。gD基因所編碼的糖蛋白是PRV入侵機體細胞所必需的，同時也是病毒主要的免疫原性蛋白之一，能刺激動物機體產生中和抗體[12-13]。gE基因是PRV的主要的毒力基因，決定PRV在細胞間的擴散，對病毒侵染神經系統(tǒng)也具有重要作用，對PRV毒力至關重要。同時，它也是所有的PRV野毒株均含有的一個非必需基因，缺失后可保持其免疫原性且毒力也大大降低，目前在許多國家都在使用gE基因的缺失疫苗[14-15]。中國也主要選用gE基因缺失疫苗防控豬偽狂犬病，雖然偶爾有病毒分離的報道[16]，但總體而言該病得到了有效的控制。

但自2012年以來，我國多個省份的豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫豬場發(fā)生豬偽狂犬病的流行，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現了新的發(fā)病特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經濟損失[17-19]。分析原因可能有兩個：一是現在流行的毒株發(fā)生變異，并存在免疫逃逸現象；二是現在流行的PRV毒株毒力變強，從而導致免疫失敗。但究竟是何種原因引起豬群中PRV突然大面積暴發(fā)，是當前迫切需要解決的一個重大問題。因此，為了研究PRV新流行株的特征，本研究對2014年12月，龍巖學院動物醫(yī)學研究所接診的一例典型豬偽狂犬病發(fā)病仔豬腦組織進行了PRV新流行毒株的分離鑒定及其重要毒力基因的克隆與序列分析，以期為該病的病因探索及新型疫苗的研制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 病料、細胞及實驗動物 病料采集于2014年12月，龍巖學院動物醫(yī)學研究所接診的江西省撫州市某免疫PRV Bartha-k61 弱毒疫苗的規(guī)模化豬場臨床癥狀疑似為PRV感染的4頭23日齡發(fā)病仔豬。發(fā)病仔豬臨床表現為：精神萎靡、體溫升高、流清鼻涕、打噴嚏、眼結膜分泌物增多、運動不協(xié)調及拉稀等癥狀；Vero 細胞由本實驗室保存；BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM 購自Gbico公司；胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司。DL 2 000 DNA Marker、LATaq DNA 聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、Universal Genomic DNA Extraction Kit，pMD18-T克隆載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；PRV陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所；FITC標記山羊抗豬二抗購自Jackson公司。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank中登錄的PRV基因組序列(NC_006151)設計6對特異性引物，分別用于疑似PRV感染組織病料檢測和TK、gB、gC、gD及gE全基因擴增(表1)。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4 DNA的提取及PCR擴增 根據TaKaRa公司Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒說明書提取PRV DNA，利用上述引物分別擴增PRVTK、gB、gC、gD及gE基因片段。PCR體系總體積25 μL：DNA模板1 μL、2×GC Buffer I 12.5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1 μL、LATaq酶0.25 μL，用ddH2O補至 25 μL。 PCR程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，67.5 ℃(TK)、53 ℃(gC)、62.5 ℃(gD)或 64 ℃(gE-JD、gE、gB)退火50 s， 72 ℃延伸1 min(gE-JD、TK)、2 min(gC、gD、gE)或3 min(gB)，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 病毒的分離培養(yǎng) 將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿液，-20 ℃反復凍融3次，12 000 r/min離心20 min，取上清經0.22 μm濾器過濾除菌后接種 Vero 單層細胞進行培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變(CPE)，待 CPE 達到80%時左右時收毒，凍融1次后，連續(xù)在 Vero 細胞中傳代擴大培養(yǎng)。

1.5.2 IFA鑒定 將經6輪空斑純化后的病毒接種Vero細胞，約24 h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次。用 500 μL 4%預冷多聚甲醛固定30 min，然后加入5%BSA室溫封閉30 min，棄去BSA，加入500 μL用0.5%BSA稀釋的陽性血清，室溫孵育2 h。洗滌后加入FITC標記山羊抗豬二抗，室溫孵育1 h。吸棄二抗，用PBS洗干凈后，封片。置熒光顯微鏡下觀察。

1.5.3 小鼠感染試驗 選取6周齡BALB/c小鼠6只，其中3只經腹股溝皮下接種經6輪空斑純化后的F3代分離毒每只0.1 mL，另外3只小鼠注射等體積DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照，觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

表1 PRV TK、gB、gC、gD和gE基因擴增引物

1.6TK、gB、gC、gD及gE基因序列分析 分別采用TK、gB、gC、gD及gE特異性引物，以提取的病毒分離株細胞培養(yǎng)物DNA為模板，對TK、gB、gC、gD及gE基因編碼區(qū)進行PCR擴增，并將擴增產物克隆于pMD18-T載體中進行序列測定。利用生物學分析軟件DNAStar7.1將分離株與GenBank中登錄的其他PRV參考毒株的TK、gB、gC、gD及gE核苷酸序列進行比對，分析分離株的序列特征。

2 結 果

2.1 病料樣品檢測 將4頭疑似PR發(fā)病豬的腦組織進行勻漿，提取總DNA，以其為模板利用gE基因特異性引物進行PCR擴增。結果顯示4頭發(fā)病豬的腦組織樣品在400 bp左右均有一特異性條帶，與預期結果相符，表明送檢樣品均為PRV陽性(圖1)。

2.2 病毒的分離培養(yǎng) 將其中1頭發(fā)病仔豬的腦組織病料勻漿液經0.22 μm濾器過濾除菌后，接種Vero細胞，24 h后即可以觀察到細胞圓縮、聚集，36 h后出現典型的拉網CPE，有的形成合胞體(圖2A)，48 h后細胞開始脫落。而空白對照組細胞形態(tài)正常(圖2B)。利用gE特異性引物對培養(yǎng)物進行PCR鑒定，能夠擴增到預期片段，這表明能從病料中分離出PRV野毒株。

2.3 病毒的IFA鑒定 將經6輪空斑純化后的病毒接種Vero細胞，約24 h后將適宜稀釋度的陽性血清作為一抗孵育進行IFA鑒定，結果表明病毒感染能產生典型的細胞病變，同時熒光顯微鏡下能夠顯示強烈的綠色熒光(圖3A)。陰性對照細胞形態(tài)正常，無特異熒光出現(圖3B)。上述這些結果均表明從發(fā)病仔豬的腦組織中分離到一株PRV野毒，將其命名為PRV Jiangxi-FZ株。

M: DNA Marker (DL2 000); 1-4: Pig brain samples; 5: Negative control

圖1 腦組織樣品偽狂犬病毒PCR鑒定結果

Fig.1 PCR amplification of PRV gE fragment from pig brain samples

A: Infected Vero cells; B: Normal Vero cells.

圖2 PRV Jiangxi-FZ株感染Vero細胞產生的CPE情況(200×)

Fig.2 Cytopathogenic effects of Vero cells infected with PRV Fujian-LY strain (200×)

A:IFA was performed on Vero cells infected with Jiangxi-FZ using PRV antibody; B: IFA was performed on normal Vero cells using pig serum

圖3 PRV Jiangxi-FZ株感染Vero細胞間接免疫熒光檢測結果(200×)

Fig.3 IFA identification of PRV Jiangxi-FZ strain (200×)

2.4 小鼠感染試驗 BALB/c小鼠接種PRV Jiangxi-FZ株后出現了典型的偽狂犬病癥狀：發(fā)病鼠食欲廢絕，狂躁不安，頻頻舔咬接種部位，致使局部被毛脫落、皮膚出血，隨后四肢麻痹，倒地不起，最后衰竭死亡(圖4)；對照組小鼠無異常。

圖4 PRV Jiangxi-FZ株感染小鼠發(fā)病情況

2.5TK、gB、gC、gD及gE基因序列分析

2.5.1TK、gB、gC、gD及gE基因的擴增、克隆與測序 以提取的PRV Jiangxi-FZ株Vero細胞培養(yǎng)物DNA為模板，用5對特異性引物進行PCR擴增，分別獲得大小約 960 bp (TK)、2 800 bp (gB)、1 400 bp (gC)、1 200 bp (gD)及1 700 bp (gE)的PCR產物，片段大小與預期目的基因大小相一致(圖5)。將這些PCR產物分別純化回收后連接于pMD18-T載體中送Invitrogen公司測序，分別獲得正確序列。

2.5.2 TK基因序列分析 測序結果表明Jiangxi-FZ株TK基因序列全長963 bp，共編碼320個氨基酸。將其與其他8株PRV參考毒株TK基因核苷酸序列比對結果顯示，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.2%～99.8%和98.1%～99.4%。其中，與2012年國內分離的2株PRV變異株(HeN1、TJ)的核苷酸和氨基酸序列同源性最高為99.8%和99.4%，而與Min-A株的核苷酸及氨基酸序列同源性最低為99.2%和98.1%。同時，發(fā)現TK基因核苷酸序列保守性很高，只有少數位點存在突變。核苷酸序列比對發(fā)現Jiangxi-FZ株在47位和385位發(fā)生了獨特性的堿基突變，由A→G。氨基酸多序列比對結果發(fā)現，與核苷酸序列類似，TK基因氨基酸序列保守性較高，只有少數位點發(fā)生突變，其中有2個位點突變較為集中，分別是氨基酸215位由T→V和284位A→V。但值得注意的是與參考毒株相比，Jiangxi-FZ株氨基酸序列最有特征性的是發(fā)現上述47位和385位的堿基突變(A→G)引起第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G，其中，第16位氨基酸突變導致TK蛋白ATP結合結構域由- G**G*GK-轉變?yōu)? G**G*GR-，這種保守序列的轉變是否會對其功能產生影響還有待進一步研究。基于TK基因氨基酸序列進行遺傳進化樹分析結果顯示，PRV毒株共分為2個大群，毒株Min-A與其他毒株距離都很遠，為單獨一群；其余分離毒株為一群。進一步分析發(fā)現，Jiangxi-FZ株與國內Ea株處于一個相對獨立的遺傳進化分支，親緣關系較近；而與Bartha株等歐美洲毒株親緣關系相對較遠(圖6)。

M: DNA Marker (DL2000); 1:TKgene; 2:gDgene; 3:gCgene; 4:gEgene; 5:gBgene; 6: Negative control.

圖5 PRV Jiangxi-FZ株TK、gB、gC、gD及gE基因全序列PCR擴增結果

Fig.5TK,gB,gC,gDandgEgenes PCR products of PRV Jiangxi-FZ strain

2.5.3gB基因序列分析 Jiangxi-FZ株gB基因測序結果表明，序列全長2 743 bp，共編碼914個氨基酸。將其與其他13株國內外PRV參考毒株gB基因核苷酸序列比對結果顯示，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.3%～100%和97.2%～100%。其中，與7株2012年國內分離的PRV變異株(HeN1、TJ、SDWF1、SDWF2、HNBA、HNQX、HNXX)的核苷酸和氨基酸序列同源性較高分別為99.9%～100%和99.8%～100%，而與4株國外PRV經典株(Becker、Namyangju、Kaplan、Bartha)的核苷酸和氨基酸序列同源性較低分別為98.3%～98.7%和96.7%～97.7%。核苷酸多序列比對結果發(fā)現，Jiangxi-FZ株gB基因核苷酸序列之間有大量的堿基替換，主要是 G-C和 G-A之間的替換。同時，序列對比發(fā)現，Jiangxi-FZ株與7株PRV變異株gB基因核苷酸序列在幾個部位均發(fā)生了一致性的特征性變化，即在207～208 bp發(fā)生了 GA→CG的替換，215～217 bp發(fā)生了TCC→GGA的替換，223 bp發(fā)生了A→G替換，240～241 bp發(fā)生了CA→AG的替換，245發(fā)生了A→G替換，247 bp發(fā)生了G→T替換， 260 bp發(fā)生了C→A替換及285～286 bp發(fā)生了GT→CG 的替換；279～281 bp有連續(xù) 3 個堿基 CGG的插入；此外，還存在兩個部位的連續(xù)缺失，與 Bartha 株相比，224～231 bp和233 bp存在不連續(xù)的8+1個堿基的缺失。氨基酸多序列比對發(fā)現，Jiangxi-FZ株gB基因氨基酸序列和國內分離株的同源性較高，尤其是與7株PRV變異株gB基因氨基酸序列有很多相同的特征性氨基酸替換，其中最有特征性的是aa 75～aa 77 位缺失了 3 個氨基酸SPG，aa 81～aa 83位氨基酸NDV替換為DGF，aa 94位插入1個氨基酸(G)，以及aa 93～aa 97 位表位 DGAVS 不同于其他4株國外PRV經典株。這些特征性的變異可能會導致Jiangxi-FZ株和Bartha疫苗株的抗原性發(fā)生較大變化。gB基因氨基酸序列遺傳進化樹分析結果顯示，Jiangxi-FZ株與HeN1、TJ等PRV變異株處于一個相對獨立的亞遺傳分支，親緣關系較近。進一步分析發(fā)現國內經典株Ea與Jiangxi-FZ株及7株PRV變異株位于同一分支中，說明近年來流行的PRV變異毒株與Ea株的親緣關系最近。而與Bartha疫苗株等4株國外經典毒株位于不同的大分支中親緣關系較遠(圖7)。

圖6 PRV Jiangxi-FZ株與參考毒株TK基因氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

Fig.6 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences ofTKbetween Jiangxi-FZ strain and other isolations of PRVs

圖7 PRV Jiangxi-FZ株與參考毒株gB基因氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

Fig.7 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences ofgBbetween Jiangxi-FZ strain and other isolations of PRVs

2.5.4gC基因序列分析 序列測定結果表明，Jiangxi-FZ株gC完整編碼區(qū)全長1 464 bp，共編碼487個氨基酸。Jiangxi-FZ株gC基因與國內外HeN1、TJ、Ea、Becker及Bartha等12株PRV參考毒株gC基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為95.2%～99.7%和91.7%～99.4%。其中與2株PRV變異株(HeN1、TJ)的核苷酸和氨基酸序列同源性最高分別為99.7%和99.4%，而與Bartha株的核苷酸和氨基酸序列同源性最低分別為95.2%和91.7%。核苷酸多序列比對結果發(fā)現，Jiangxi-FZ株gC基因核苷酸序列和國內不同時期分離的PRV株(HeN1、TJ、Ea及Fa)gC基因核苷酸序列中有很多點突變一致，尤其是與2012年分離的2株PRV變異株(HeN1、TJ)核苷酸突變位點的一致性最高，且分布比較集中。最有特征性的是，Jiangxi-FZ株及國內最近幾年的分離株gC基因核苷酸序列在175～222 bp之間存在1個集中突變區(qū)和2個缺失區(qū)，即175～179 bp堿基序列由CCCGA突變?yōu)镚GGAC，186～188 bp 插入3個連續(xù)堿基GGC以及205～222 bp 18個連續(xù)堿基GCGGCCGTCTCGACGCCC的插入。另外，還發(fā)現只有當175～179 bp堿基序列為GGGAC時，186～188 bp及205～222 bp才存在上述連續(xù)堿基的插入。氨基酸多序列比對發(fā)現，Jiangxi-FZ株gC基因氨基酸序列和國內分離株的同源性較高，有很多相同的特征性氨基酸替換，其中最有特征性的是第aa 52～aa 69和aa 186～aa 194 位氨基酸的替換和插入。這些特征性的變異導致Jiangxi-FZ株和Bartha疫苗株的抗原性發(fā)生了較大變化。gC基因氨基酸序列遺傳進化樹分析結果顯示，Jiangxi-FZ株與HeN1株、TJ株、Ea株、Fa株及P-Prv株位于同一個大分支中，其中與HeN1株、TJ株及Ea株又形成了一個相對獨立的亞遺傳分支，親緣關系較近，說明近年來流行的PRV變異毒株與Ea株的親緣關系最近。而與Bartha疫苗株位于不同的大分支中親緣關系較遠(圖8)。

圖8 PRV Jiangxi-FZ株與參考毒株gC基因氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

Fig.8 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences ofgCbetween Jiangxi-FZ strain and other isolations of PRVs

2.5.5gD基因序列分析 對Jiangxi-FZ株gD基因序列測定結果表明，gD基因序列全長1 209 bp，共編碼402個氨基酸。與國內外HeN1、TJ、Ea、Becker及Bartha等12株PRV參考毒株gD基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.3%～99.9%和97.5%～100%。其中與2株PRV變異株(HeN1、TJ)的核苷酸和氨基酸序列同源性最高分別為99.9%和100%，而與Bartha疫苗株的核苷酸和氨基酸序列同源性最低分別為98.3%和97.5%。核苷酸多序列比對結果發(fā)現，gD基因核苷酸序列保守性較高，只有少數位點存在突變。最有特征性的是在831～836 bp之間插入了連續(xù)的 6 個堿基CCGGCC。雖然部分經典株(Fa、Yangsan、Becker)在該位點也有連續(xù)6 個堿基的插入，但Jiangxi-FZ株與2株PRV變異株(HeN1、TJ)在此位點卻高度一致。此外，Jiangxi-FZ株與2株PRV變異株(HeN1、TJ)在826位發(fā)生了一致的堿基突變，由C→A。氨基酸多序列比對發(fā)現，Jiangxi-FZ株gD基因氨基酸序列和國內分離株的同源性較高，僅有少數位點發(fā)生氨基酸替換，但在上述gD基因核苷酸序列插入連續(xù)的 6 個堿基的位置增加了2個氨基酸RP。gD基因氨基酸序列遺傳進化樹分析結果顯示，Jiangxi-FZ株與國內TJ株、HeN1株、Fa株、Min-A株、LA株、PRV-FZ株及韓國分離株Yangsan位于一個相對獨立的遺傳分支內，親緣關系較近。而與Bartha疫苗株位于不同的大分支中，親緣關系較遠(圖9)。

2.5.6gE基因序列分析 序列測定結果表明擴增片段大小為1 755 bp(其中gE基因編碼區(qū)1 740 bp，共編碼580個氨基酸)。與其他10株PRV參考毒株gE基因核苷酸序列比對結果表明，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為97.4%～99.8%和94.6%～99.5%。其中與PRV變異株TJ的核苷酸和氨基酸序列同源性最高分別為99.8%和99.5%。同時，發(fā)現不同毒株間gE基因核苷酸序列存在很多的堿基替換，其中主要是G-A和T-C之間的替換。另外，Jiangxi-FZ株gE核苷酸序列中最具特征性的變化就是在2個部位存在3個連續(xù)堿基的插入，分別是第142～144 bp位GAC的插入以及1 488～1 490 bp位CGA的插入。氨基酸多序列比對發(fā)現，與核苷酸序列類似，不同毒株間gE氨基酸序列存在很多的氨基酸替換。在上述同時出現特征性堿基插入的2個位置，在氨基酸序列上增加了2個天冬氨酸(D)，即gE氨基酸序列第48位和第496位各有1個D插入。雖然部分經典株(Ea 、LA、P-Prv)在48位也有D插入，且LA株在496位還有D插入，但Jiangxi-FZ株與2株PRV變異株(HeN1、TJ)在這2個位點卻高度一致。氨基酸系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，11株PRV共形成兩大遺傳分支，Jiangxi-FZ株與Ea株、LA株、TJ株、HeN1株等7株亞洲毒株位于同一個大遺傳分支，親緣關系相對較近。其余4株歐美毒株位于另一個大遺傳分支內。進一步分析發(fā)現，Jiangxi-FZ株與國內經典株LA形成一個相對獨立的分支內，親緣關系較近(圖10)。

圖9 PRV Jiangxi-FZ株與參考毒株gD基因氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

Fig.9 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences ofgDbetween Jiangxi-FZ strain and other isolations of PRVs

圖10 PRV Jiangxi-FZ株與參考毒株gE基因氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

Fig.10 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences ofgEbetween Jiangxi-FZ strain and other isolations of PRVs

3 討 論

目前，豬偽狂犬病疫情形勢嚴峻，2012年以來在中國多個省份許多使用PRV基因缺失活疫苗進行免疫的規(guī)模化豬場出現了豬狂犬病的流行，且發(fā)病特點和流行形勢也發(fā)生了變化[12-13,16,20-22]。面對 PRV新毒株的廣泛流行，對PRV新流行毒株進行分離鑒定及遺傳進化分析，發(fā)現流行株的變異情況，對于從分子水平上揭示當前規(guī)模化豬場偽狂犬病的存在和再次暴發(fā)的原因，提出科學有效的防治措施具有重要意義。

本研究通過PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光、小鼠模型及序列分析等方法，證實從發(fā)病仔豬腦組織中分離到了1株PRV野毒株并命名為PRV Jiangxi-FZ株。PRV屬于皰疹病毒科，毒力由幾種基因協(xié)同控制，其中TK及gE基因是PRV的主要毒力基因[12]。gB、gC及gD基因編碼的糖蛋白是PRV最主要的保護性抗原，能刺激動物產生中和抗體和病毒特異性的細胞免疫應答反應[7-8,13]。因此，對PRV流行毒株TK、gB、gC、gD及gE基因進行序列分析及遺傳進化分析能在一定程度上反映病毒變異情況。對其重要毒力基因TK、gB、gC、gD及gE的全序列分析結果顯示，Jiangxi-FZ株與其他PRV參考毒株的TK、gB、gC、gD及gE基因在核苷酸和氨基酸水平均具有很高的保守性，尤其是與2012年分離的2株PRV變異株的同源性較高。但在高度保守的基礎上，仍存在一些差異，且部分差異具有特征性。其中，最具特征性的是Jiangxi-FZ株TK基因核苷酸序列第47位和385位出現了獨特性的堿基突變，均由A→G，并造成第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中第16位氨基酸突變，導致TK蛋白ATP結合結構域，即- G**G*GK-發(fā)生改變，轉變?yōu)? G**G*GR-。TK蛋白ATP結合結構域由3個甘氨酸(G)殘基形成一個疏水的袋狀構象，它們對皰疹病毒的毒力有很大影響，若3個G中有一個發(fā)生突變，就會影響 TK蛋白的構象及其與ATP的結合，進而導致TK蛋白活性喪失[23]。雖然，Jiangxi-FZ株TK蛋白中這3個位點發(fā)生突變，但其第16位氨基酸的突變，是否會對PRV的毒力產生影響還有待進一步研究。Jiangxi-FZ株gE基因核苷酸序列和國內分離株的同源性較高，尤其是與2株PRV變異株gE基因有很多相同的特征性堿基替換，其中最具特征性的變化就是在2個部位存在3個連續(xù)堿基的插入，進而導致gE基因氨基酸序列第48位和第496位各有一個天冬氨酸(D)的插入，該插入特征為PRV變異毒株的重要標志[12-15]，表明Jiangxi-FZ株為PRV變異毒株。

gB、gC及gD基因序列分析結果顯示，Jiangxi-FZ株與7株PRV變異株gB基因核苷酸序列同源性較高，在幾個部位均發(fā)生了一致性的特征性變化，進而導致gB基因氨基酸序列有很多相同的特征性氨基酸替換。gC基因核苷酸序列最有特征性的是核苷酸序列第175～222 bp之間存在1個集中突變區(qū)和2個缺失區(qū)，并且發(fā)現只有當175～179 bp堿基序列為GGGAC時，186～188 bp及205～222 bp 才存在上述連續(xù)堿基的插入，這與前人報道一致[11]。氨基酸序列中最有特征性的是第 aa 52～aa 69和aa 186～aa 194位氨基酸的替換和插入。gD基因核苷酸序列最有特征性的是在831～836 bp之間插入了連續(xù)的6個堿基CCGGCC，進而引起氨基酸序列在相應位置增加了2個氨基酸RP。雖然部分參考毒株在該位置也有連續(xù)6 個堿基的插入，但Jiangxi-FZ株與2株PRV變異株在此位點卻高度一致。這些特征性的變異導致Jiangxi-FZ株和Bartha疫苗株的抗原性發(fā)生了較大變化。基于Jiangxi-FZ株TK、gB、gC、gD及gE基因氨基酸序列的進行遺傳進化樹分析結果表明，Jiangxi-FZ株與HeN1、TJ等PRV變異株處于一個相對獨立的遺傳分支，親緣關系較近。進一步分析發(fā)現，在PRV經典株Jiangxi-FZ株與國內Ea株親緣關系較近；而與Becker等歐美洲毒株親緣關系相對較遠。

綜上所述，本研究中所分離培養(yǎng)的PRV Jiangxi-FZ野毒株具有一定的當前PRV流行毒株的代表性，屬于PRV變異毒株。研究結果對豬偽狂犬病病因的探索及PRV新型疫苗的研制提供理論依據。

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Identification and molecular characteristics of important virulence genes of porcine pseudorabies virus strain Jiangxi-FZ

FAN Ke-wei1,2,DAI Ai-ling1,2,WU De-feng3,LIN Wei-ming1,2,LU Ma-ying1,YANG Xiao-yan1,2

(1.CollegeofLifeSciences,LongyanUniversity,Longyan364000,China; 2.FujianProvincialKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineandVeterinaryBiotechnology,Longyan364000,China; 3.CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)

To study the molecular characteristics of important virulence genes of Porcine pseudorabies virus (PRV) new epidemic strains, one local strain of PRV was isolated from the brain of a 23-day old pig in Jiangxi Province, and was identified by necropsy, PCR, virus isolation and culture, IFA and animal test. It was named as the PRV Jiangxi-FZ strain. The analysis of molecular characteristic and phylogenetic relationship of its important virulence genes TK, gB, gC, gD and gE showed that the TK, gB, gC, gD and gE gene sequences of Jiangxi-FZ strain shared a strictly conservative with other reference PRV strains at the nucleotide and amino acid levels, especially shared higher homology with 2 PRV variants isolated in 2012. However, there were still some differences between the nucleotide sequences and amino acid sequences of TK, gB, gC, gD and gE genes of Jiangxi-FZ strain and other reference PRV strains on the highly conservative basis, and a part of these differences were characteristic. Phylogenetic analysis showed that the PRV Jiangxi-FZ strain and the PRVs isolated from different provinces in China since 2012 had more closely relationship far away from the European and American PRV strains. Jiangxi-FZ strain had a certain representative of the PRV current epidemic strains, which belong to the PRV variants prevailing in China in recent years.

pseudorabies virus; isolation and identification; virulence gene; molecular characteristic

Yang Xiao-yan, Email:lyyxy1988@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.004

楊小燕,Email：lyyxy1988@126.com

1.龍巖學院生命科學學院,龍巖 364012； 2.福建省預防獸醫(yī)學與獸醫(yī)生物技術重點實驗室,龍巖 364012； 3.福建農林大學動物科學學院,福州 350002

R373.9

A

1002-2694(2015)12-1103-08

2015-07-13；

2015-10-27

福建省農業(yè)科技重大專項項目(No.2014NZ01060015)和福建省教育廳資助省屬高校項目(No.JK2013052)聯(lián)合資助

Supported by the Fujian Agricultural Science and Technology Major Project (No.2014NZ01060015), and the Fujian Provincial Department of Education Funding Universities Project (No.JK2013052).