貝氏柯克斯體5種重組表面蛋白抗原包被酶聯免疫吸附試驗的特異性和敏感性分析

汪鵬程，熊小路，焦 俊，龔文平，楊小梅，溫博海

貝氏柯克斯體5種重組表面蛋白抗原包被酶聯免疫吸附試驗的特異性和敏感性分析

汪鵬程1,2，熊小路1，焦 俊1，龔文平1，楊小梅1，溫博海1

目的 使用貝氏柯克斯體5種重組表面蛋白作為包被抗原的酶聯免疫吸附試驗用于血清學檢測的特異性和敏感性分析。方法 本研究建立由貝氏柯克斯體的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組表面蛋白抗原分別包被的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法，然后分別檢測貝氏柯克斯體實驗感染小鼠血清和Q熱患者血清中IgG特異性抗體。結果 8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清中除1份血清與RplL反應為陰性外其它均為陽性；11份Q熱患者血清中除1份血清與RplL、1份血清與OmpH反應為陰性外，其它血清反應均為陽性。將這5種重組蛋白分別與莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體實驗感染小鼠血清反應，除1份黑龍江立克次體感染小鼠血清與GroEL反應為陽性外，其它血清反應均為陰性。另外，Com1對斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病患者血清的陽性反應率平均為22.2%，GroEL為25.0%，Mip為25.0%，OmpH為25.0%，RplL為13.9%。結論 這些結果證明這5種重組蛋白抗原均可被貝氏柯克斯體感染血清所識別。所建立的ELISA方法具有良好特異性和敏感性，可用作Q熱血清學診斷。

貝氏柯克斯體；Q熱； 表面蛋白；酶聯免疫吸附試驗

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31170161) and the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004803). Corresponding authors: Xiong Xiao-lu, Email:xiongxlu624@sohu.com; Wen Bo-hai, Email:bohaiwen@sohu.com

Q熱(Q fever)是由貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)引起的一種重要的人獸共患病，為全球性廣泛分布[1]。人群Q熱暴發流行常常源于羊群的貝氏柯克斯體暴發感染，因此“Q熱”又俗稱“羊流感”。貝氏柯克斯體易感染家畜，主要是羊、牛，導致孕畜流產，給畜牧業造成嚴重經濟損失；而貝氏柯克斯體感染的家畜又是人Q熱的主要傳染源，可引起人群Q熱的暴發和流行。2007年荷蘭大范圍暴發由貝氏柯克斯體感染羊所致的“羊流感”，造成數千人感染和多人死亡,引起了國際社會強烈關注[2]。流行病學調查顯示Q熱疫區遍布世界各國，在我國的分布十分廣泛,目前至少有20多個省市自治區報道過Q熱病例,其中四川、云南、內蒙、新疆和西藏等地還發生過Q熱的流行[3]。Q熱早期主要表現為發熱、疲乏等，無特異性的臨床癥狀，容易誤診為一般的流感。因此，早期確診對于Q熱患者的有效治療與Q熱流行的控制十分重要。

人Q熱診斷主要依賴血清學診斷，常用方法為間接免疫熒光試驗(IFA)。由于貝氏柯克斯體為感染性很強的呼吸道傳播病原菌，需要在高等級生物安全實驗室培養，因此難以在普通實驗室制備大量IFA抗原片供Q熱血清學診斷，另外由于IFA操作較為復雜、難以標準化等限制IFA血清學診斷Q熱在臨床實驗室推廣應用。目前，國際上已采用貝氏柯克斯體抗原進行酶聯免疫吸附分析(ELISA)代替IFA作為Q熱實驗室診斷的方法。

本實驗室采用免疫蛋白質組學[4]和表面蛋白質組學[5]等方法，鑒定出Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL等為貝氏柯克斯體主要菌體表面蛋白，并證明其為主要血清免疫源性蛋白，可以作為Q熱血清學診斷候選抗原，因此，本實驗室已克隆表達5種主要表面蛋白抗原，制備Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白。本研究用這5種重組蛋白作為抗原建立ELISA方法,檢測貝氏柯克斯體實驗感染小鼠血清以及Q熱患者血清對重組蛋白的反應性，并同時檢測其它立克次體感染小鼠血清和患者血清，以初步評價這5種重組蛋白為抗原的ELISA的特異性和敏感性，為其進一步的臨床應用提供必要的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Ni-NTA純化試劑盒為德國QIAGEN產品；低分子量蛋白Marker等為中科瑞泰(北京)生物科技有限公司產品；FITC、HRP標記羊抗小鼠/人IgG為北京博奧森公司產品；96孔ELISA板購自美國康寧公司。ELISA包被液、封閉液、TMB反應底物、終止液均購自eBioscience公司。貝氏柯克斯體、黑龍江立克次體、莫氏立克次體、恙蟲病東方體等IFA抗原片為本實驗室制備。

1.2 立克次體菌株與實驗感染小鼠血清 貝氏柯克斯體(新橋株)、莫氏立克次體(Wilmington株)、黑龍江立克次體(054株)、恙蟲病東方體(Karp株)為軍事醫學科學院微生物流行病研究所立克次體學實驗室保存。用以上立克次體分別腹腔接種6周齡BALB/c小鼠，感染4周后取血，分離血清-20 ℃凍存備用。血清用相應的立克次體抗原片間接免疫熒光檢測，結果顯示效價≥1∶200。

1.3 立克次體患者血清 Q熱、斑點熱、斑疹傷寒、恙蟲病患者血清分別由安徽醫科大學公共衛生學院柳燕教授、廣州市第八人民醫院、江蘇省疾病預防控制中心惠贈。以上患者血清用相應的立克次體抗原片按常規方法使用間接免疫熒光檢測，結果顯示效價均≥1∶100。

1.4 貝氏柯克斯體重組蛋白制備 將本室制備的表達貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大腸埃希氏菌[4]分別接種含氨芐青霉素100 μg/mL的LB培養基，37 ℃培養2 h后加入終濃度為240 μg/mL的IPTG誘導表達4 h，然后對誘導表達菌做聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以鑒定其是否能夠表達目的蛋白。將鑒定后的大腸埃希氏菌接種含氨芐青霉素的LB液體培養基，并用IPTG誘導大腸埃希氏菌表達目的蛋白，然后用Qiagen公司的Ni-NTA試劑盒從大腸埃希氏菌中親和層析純化目的蛋白。

1.5 重組蛋白與立克次體感染小鼠血清或患者血清做ELISA分析 用ELISA包被液稀釋貝氏柯克斯體重組蛋白至3 μg/mL，再將其分別加到ELISA板(每孔100 μL)4 ℃包被過夜。包被結束后棄上清，加入PBST(含0.05%Tween的PBS)進行洗滌(每孔加入200 μL，搖振5 min)，拍干后每孔加入200 μL封閉液4 ℃過夜，PBST洗滌3次后待用。用大腸埃希氏菌裂解液(5 mg/mL)中和每份待檢血清，然后用封閉液對其作1∶200稀釋。將每份稀釋血清加入到相應孔中，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后每孔加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗小鼠或人IgG抗體(每孔100 μL)，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后每孔加入100 μL TMB底物，10 min后加入100 μL終止液，立即于酶標儀上測定每孔OD450值。

1.6 統計學分析 各組血清與單個蛋白反應OD450值差異采用單因素K平方差分析及Student-Newman-Keuls分析，P值<0.05為差異有統計學意義。以上統計學分析均使用SAS 9.1軟件完成。統計正常血清與每個蛋白反應OD450值，以正常小鼠血清或正常人血清與單個蛋白反應OD450平均值加3倍標準差為cut-off值來判斷感染血清與該蛋白反應陽性及陰性結果。

2 結 果

2.1 貝氏柯克斯體重組蛋白的純化 將表達貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大腸埃希氏菌分別接種含有氨芐青霉素LB液體培養基并使用IPTG誘導重組蛋白表達；采用Ni-NTA對表達的重組蛋白進行分離純化，SDS-PAGE分析確認表達的重組蛋白分子量與預期大小一致(圖1)。

圖1 SDS-PAGE分析貝氏柯克斯體5種重組蛋白在大腸埃希氏菌表達

Fig.1 Expression of 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiiinE.colicells analyzed by SDS-PAGE

2.2 ELISA分析貝氏柯克斯體重組蛋白與感染小鼠血清反應 將貝氏柯克斯體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體感染小鼠血清以及正常小鼠血清各8份與5種貝氏柯克斯體蛋白進行ELISA反應，結果顯示5種貝氏柯克斯體重組蛋白中除RplL與1份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應為陰性外，其它蛋白與8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應均為陽性，每種蛋白與8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應的OD值均顯著高于與其它立克次體感染小鼠血清反應的OD值(Com1:F=36.509,P<0.001; GroEL:F=67.436,P<0.001; Mip:F=631.337，P<0.001; OmpH:F=17.636,P<0.001; RplL:F=17.733,P<0.001)。其它立克次體感染小鼠血清與這5種貝氏柯克斯體蛋白反應，除GroEL與1份黑龍江立克次體感染血清反應為陽性外，其余均為陰性，見表1和圖2。

2.3 ELISA分析貝氏柯克斯體重組蛋白與患者血清反應 將11份Q熱、13份斑點熱、12份恙蟲病、11份斑疹傷寒患者血清、17份正常人血清與5種貝氏柯克斯體蛋白進行ELISA反應，結果顯示5種貝氏柯克斯體重組蛋白至少與11份Q熱患者血清反應陽性，每一種蛋白與Q熱患者血清的平均OD值均顯著高于與其它立克次體病患者血清的反應值(Com1:F=44.902,P<0.001; GroEL:F=26.263,P<0.001; Mip:F=30.445,P<0.001; OmpH:F=23.455，P<0.001; RplL:F=23.704,P<0.001)。其它立克次體感染患者血清與這5種貝氏柯克斯體蛋白的反應陽性數為0或1～4份，見表2，圖3。

表1 立克次體感染小鼠血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應OD450值及陽性數

Tab.1 Reaction intensities and positive rates of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重組蛋白Recombinantprotein小鼠血清Serafrommiceinfectedwithdifferentrickettsiae貝氏柯克斯體莫氏立克次體黑龍江立克次體恙蟲病東方體正常血清CoxiellaburnetiiRickettsiamooseriRickettsiaheilongjiangensisOrientiatsutsugamshiNormalseraCom10.885±0.319(8/8,100%)0.209±0.021(0/8,0%)0.204±0.021(0/8,0%)0.207±0.021(0/8,0%)0.162±0.036(0/8,0%)GroEL1.324±0.386(8/8,100%)0.191±0.020(0/8,0%)0.209±0.055(1/8,12.5%)0.189±0.027(0/8,0%)0.145±0.032(0/8,0%)Mip1.126±0.110(8/8,100%)0.191±0.017(0/8,0%)0.184±0.019(0/8,0%)0.177±0.026(0/8,0%)0.180±0.033(0/8,0%)OmpH0.881±0.483(8/8,100%)0.170±0.011(0/8,0%)0.161±0.015(0/8,0%)0.155±0.010(0/8,0%)0.163±0.032(0/8,0%)RplL0.657±0.334(7/8,87.5%)0.168±0.011(0/8,0%)0.164±0.011(0/8,0%)0.146±0.011(0/8,0%)0.140±0.046(0/8,0%)

3 討 論

貝氏柯克斯體主要血清反應蛋白Com1是最早鑒定的貝氏柯克斯體外膜蛋白[6]，GroEL是一種熱休克蛋白 (HspB)[7]，Mip是一種與毒力相關、存在菌體表面的肽基脯氨酸異構酶[8]，OmpH 是一種促進菌體內蛋白向菌體外釋放的外膜伴侶蛋白[9]，RplL則是一種細菌核糖體蛋白(L12)。這些蛋白均可存在菌體表面，當貝氏柯克斯體感染時，誘導機體免疫應答，產生特異性抗體。因此，本研究使用Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白分別作為包被抗原進行ELISA，檢測貝氏柯克斯體感染血清以及其他幾種主要立克次體感染血清中抗體，分析這5種貝氏柯克斯體蛋白抗原在Q熱血清學診斷中的特異性和敏感性。

圖2 立克次體感染小鼠血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應強度散點圖

Fig.2 Reaction intensities of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

表2 立克次體感染患者血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應OD450值及陽性率

Tab.2 Reaction intensities and positive rates of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重組蛋白Recombinantprotein患者血清erafrompatientssufferedfromdifferentrickettsialdiseasesQ熱斑疹傷寒斑點熱恙蟲病正常血清QfeverEndemictyphusSpottedfeverTsutsugamushiNormalseraCom10.901±0.241(11/11,100%)0.311±0.116(2/11,18.2%)0.327±0.142(3/13,23.1%)0.327±0.142(3/12,25%)0.186±0.058(0/17,0%)GroEL0.882±0.388(11/11,100%)0.310±0.081(3/11,27.3%)0.332±0.139(4/13,30.8%)0.295±0.118(2/12,16.7%)0.178±0.074(0/17,0%)Mip0.798±0.257(11/11,100%)0.329±0.093(2/11,18.2%)0.346±0.164(4/13,30.8%)0.346±0.102(3/12,25%)0.186±0.071(0/17,0%)OmpH0.739±0.280(10/11,90.9%)0.349±0.115(3/11,27.3%)0.343±0.160(4/13,30.8%)0.284±0.080(2/12,16.7%)0.183±0.069(0/17,0%)RplL0.544±0.156(10/11,90.9%)0.290±0.106(3/11,27.3%)0.292±0.117(2/13,15.4%)0.235±0.067(0/12,0%)0.163±0.065(0/17,0%)

檢測結果顯示8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清中除1份血清與RplL蛋白反應為陰性外其它均為陽性；11份Q熱患者血清中除1份血清與RplL蛋白、1份血清與OmpH蛋白反應為陰性外，其它血清反應均為陽性。該結果證明這些蛋白做ELISA診斷抗原檢測Q熱特異性IgG抗體有很好的敏感性。將這5個重組蛋白與莫氏立克次體(地方性斑疹傷寒病原體)、黑龍江立克次體(遠東斑點熱病原體)、恙蟲病東方體(恙蟲病病原體)感染小鼠血清反應，除1份黑龍江立克次體感染小鼠血清與GroEL反應為陽性外，其它血清反應均為陰性，證明這5種重組蛋白抗原均可被貝氏柯克斯體感染血清所識別。所建立的ELISA方法具有良好特異性和敏感性，可用作Q熱血清學診斷。為進一步分析這5種重組蛋白在Q熱血清學診斷中的特異性，將這5種重組蛋白分別作為抗原進行ELISA，檢測11份斑疹傷寒患者血清、13份斑點熱患者血清、12份恙蟲病患者血清。結果顯示Com1對這3種立克次體感染患者血清的陽性反應率平均為22.2%，GroEL為25.0%，Mip為25.0%，OmpH為25.0%，RplL為13.9%。提示熱休克蛋白GroEL、肽基脯氨酸異構酶Mip、外膜蛋白OmpH為細菌的保守蛋白，其血清學交叉反應較明顯。由于本研究所收集的患者血清絕大多數來自農村地區，Q熱為農村常見病，因此這些貝氏柯克斯體IgG抗體陽性的斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病患者可能曾經患過Q熱。因此，可使用這5種貝氏柯克斯體蛋白抗原進行ELISA，檢查患者血清中的特異性IgM抗體可以排除這種血清交叉反應，提高ELISA血清學診斷的特異性。

圖3 立克次體感染患者血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應強度散點圖

Fig.3 Reaction intensities of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

本研究首次將貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白分別作為ELISA包被抗原，檢測貝氏柯克斯體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體實驗感染小鼠血清和臨床患者血清，檢測結果證明它們均有識別貝氏柯克斯體感染血清的良好特異性和敏感性。Q熱為我國農村地區常見傳染病，使用這5種貝氏柯克斯體重組蛋白抗原建立的ELISA將為我國Q熱血清學診斷提供新的有效方法。

[1]Maurin M, Raoult D. Q fever[J]. Clin Microbiol Rev, 1999, 12(4): 518-553

[2]Roest HI, Tilburg JJ, van der Hoek W, et al. The Q fever epidemic in The Netherlands: history, onset, response and reflection[J].Epidemiol Infect,2011,139(1):1-12.DOI: 10.1017/S0950268810002268.

[3]He LY, Xu CB. Tropical medicine[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2004: 355-359. (in Chinese) 賀聯印,許熾熛.熱帶醫學[M].北京:人民衛生出版社,2004:355-359.

[4]Xiong XL, Wang XL, Wen BH, et al. Potential serodiagnostic markers for Q fever identified inCoxiellaburnetiiby immunoproteomic and protein microarray approaches[J]. BMC Microbiol, 2012, 12: 35. DOI: 10.1186/1471-2180-12-35

[5]Jiao J, Xiong XL, Qi Y, et al. Serological characterization of surface-exposed proteins ofCoxiellaburnetii[J]. Microbiology, 2014, 160(12): 2718-2731. DOI: 10.1099/mic.0.082131-0

[6]Hendrix LR, Samuel JE, Mallavia LP. Identification and cloning of a 27-kDaCoxiellaburnetiimmunoreactive protein[J]. Ann N Y Acad Sci, 1990, 590: 534-540.

[7]Vodkin MH, Williams JC. A heat shock operon inCoxiellaburnetiproduces a major antigen homologous to a protein in both mycobacteria andEscherichiacoli[J].J Bacteriol, 1988, 170(3): 1227-1234.

[8]Mo YY, Cianciotto NP, Mallavia LP. Molecular cloning of aCoxiellaburnetigene encoding a macrophage infectivity potentiator (Mip) analogue[J].Microbiology,1995, 141(11): 2861-2871.

[9]Dumetz F, Duchaud E, LaPatra SE, et al. A protective immune response is generated in rainbow trout by an OmpH-like surface antigen (P18) ofFlavobacteriumpsychrophilum[J]. Appl Envir Microbiol, 2006, 72(7): 4845-4852.

Specificity and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay with five recombinant surface protein antigens ofCoxiellaburnetii

WANG Peng-cheng1,2,XIONG Xiao-lu1,JIAO Jun1,GONG Wen-ping1,YANG Xiao-mei1,WEN Bo-hai1

(1.StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,the105thHospitalofPLA,Hefei230031,China)

In order to evaluate the usefulness of recombinant proteins ofCoxiellaburnettias serodiagnostic markers for Q fever, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coated with each of five recombinant surface protein antigens (Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL) ofCoxiellaburnetiiwas assessed for specificity and sensitivity in detection of specific IgG antibodies in sera from mice experimentally infected withC.burnetiiand patients suffered from Q fever. As a result, all of 8 sera fromC.burnetii-infected mice positively reacted with the five recombinant proteins, except for one serum which negatively reacted with RplL, while all of 8 sera from mice infected withRickettsiamooseri,Rickettsiaheilongjiangensis, orOrientiatsutsugamshinegatively reacted with the five proteins, except for one serum which positively reacted with GroEL. In addition, the average positive ratio of 11 sera from patients with endemic typhus, 13 sera from patients with spotted fever, and 12 sera from patients with tsutsugamushi disease were 22.2% for reaction to Com1, 25.0% for GroEL, 25.0% for Mip, 25.0% for OmpH, and 13.9% for RplL, respectively. Results suggest that the ELISA with Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL has high specificity and sensitivity for serological diagnosis of Q fever.

Coxiellaburnetii; Q fever; surface protein; enzyme-linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.005

國家自然科學基金(No.31170161)和國家科技重大項目(No.2013ZX10004803)聯合資助

熊小路，Email: xiongxlu624@sohu.com; 溫博海，Email: bohaiwen@sohu.com

1.軍事醫學科學院微生物流行病研究所，病原生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071;

2.中國人民解放軍第105醫院檢驗科，合肥 230031

R446.5

A

1002-2694(2015)12-1111-05

2015-03-09；

2015-06-11