苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝的優(yōu)化

林巧

摘要：基于ELISA檢測方法，對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，尋求苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1最佳提取條件。通過空白加標(biāo)回收試驗(yàn)、樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，證明ELISA檢測方法的可行性，對料液比、超聲時(shí)間、超聲振幅3個(gè)變量進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，用ELISA檢測黃曲霉毒素B1的方法是切實(shí)可行的，在提取液溶劑配比甲醇 ∶ 水為6 ∶ 4、料液比為1 ∶ 5、最佳超聲時(shí)間15 min、最佳超聲振幅15Φ的條件下能得到最佳提取效果。

關(guān)鍵詞：苦蕎麥;提取;黃曲霉毒素B1;ELISA

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0302-03

收稿日期：2014-04-30

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：13ZA0157）。

作者簡介：林 巧（1978—），女，碩士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)與微生物研究。E-mail：13778672269@163.com。

苦蕎麥會(huì)在貯藏加工過程中污染黃曲霉毒素，黃曲霉毒素毒性極強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性，其中以黃曲霉毒素B1毒性最大。ELISA試驗(yàn)是一種特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好的試驗(yàn)方法。本試驗(yàn)采用ELISA檢測苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1，為了加強(qiáng)黃曲霉毒素的溶解度及擴(kuò)散，有利于毒素的提取完全，利用超聲波輔助提取。本試驗(yàn)研究了不同條件對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取效果的影響，通過ELISA試劑盒對黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行測定，對提取方法中溶劑配比、料液比、超聲時(shí)間、超聲頻率進(jìn)行優(yōu)化，從而得到黃曲霉毒素B1的最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎麥麩：從西昌航飛科技發(fā)展有限公司采集苦蕎麥麩皮粉。

1.2 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀，美國熱電公司生產(chǎn);MS2型微量振蕩器，德國IKA公司生產(chǎn);微量移液器，芬蘭雷勃公司生產(chǎn);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱，上海悅豐儀器儀表有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

ELISA試劑盒，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;甲醇、無水乙醇、三氯甲烷、分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗(yàn) 將溶劑甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。在空白提取溶劑中加入不同量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，使其每組最終濃度分別達(dá)到0.1、1.0、2.0 μg/L[1]。用ELISA法檢測，同時(shí)做5組平行。按如下公式計(jì)算：

回收率=檢測出AFB1的含量添加入的AFB1的含量×100%。 1.4.2 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn) 將甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品，裝入25 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入 10 mL提取溶液，超聲振幅為3Φ，超聲萃取10 min，離心取上清液，即為待測樣品提取液。測定原樣品中黃曲霉毒素B1的含量，按1 ∶ 1比例加入濃度分別為0.1、1.5、5.0 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品50 μL[2]。用ELISA檢測。按如下公式計(jì)算：

回收率=總的AFB1含量-原樣品中AFB1含量添加入AFB1的量×100%。

1.4.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響 用6 ∶ 4的甲醇作溶劑，準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品，裝入25 mL具塞離心管中，按照料液比1 g ∶ 4 mL、1 g ∶ 5 mL、1 g ∶ 6 mL、1 g ∶ 7 mL、1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 9 mL加入溶劑，超聲振幅為3Φ，超聲波萃取10 min，離心取上清液，即為待測樣品提取液[3]，用ELISA檢測。

1.4.4 不同超聲時(shí)間對黃曲霉毒素B1提取的影響 選用提取溶劑比6 ∶ 4和料液比1 g ∶ 5 mL進(jìn)行試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品，裝入25 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液，超聲波萃取，振幅為3 Φ，時(shí)間分別采用5、10、15、25、35、50 min，離心取上清液，即為待測樣品提取液[4]，用ELISA檢測。

1.4.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響 采用最佳提取溶劑6 ∶ 4、料液比1 g ∶ 5 mL、超聲時(shí)間15 min進(jìn)行試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品，裝入25 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液，超聲波萃取，振幅分別為3、6、10、15、20 Φ，離心取上清液，即為待測樣品提取液。用ELISA檢測。

1.4.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)原理，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲振幅（C）對黃曲霉毒素B1提取影響顯著的3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，選用L9（33）正交表，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，最后在一定水平范圍內(nèi)取最佳值[5]。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表 1。

1.5 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1含量的測定

1.5.1 樣品處理 取經(jīng)過上述超聲處理后的提取溶劑 5 mL，加入10 mL三氯甲烷，振蕩5 min，離心分層， 取出下層

表1 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

水平

因素

A：料液比

（g ∶ mL） B：超聲時(shí)間

（min） C：超聲振幅

（Φ）

1 1 ∶ 4 10 10

2 1 ∶ 5 15 15

3 1 ∶ 6 20 20

三氯甲烷相;向上層水相中再加入10 mL三氯甲烷，按上述方法重復(fù)提取1次，合并三氯甲烷相;于50 ℃下水浴蒸干;加入2 mL樣品提取液，溶解揮干物;再加入8 mL樣品稀釋液進(jìn)行稀釋;取稀釋后液體待測。endprint

1.5.2 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對應(yīng)的微孔中，加AFB1酶標(biāo)物50 μL/孔，再加入AFB1抗試劑50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置 37 ℃ 避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

1.5.3 洗板 小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔30 s，用吸水紙拍干。

1.5.4 顯色 加入底物液A液50 μL/孔，再加底物液B液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37 ℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min。

1.5.5 測定 加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于雙波長D450 nm/D630 nm檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)，測定每孔D值。

1.5.6 ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線 用ELISA標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、100、250、500、1 500、5 000 ng/L進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。利用RIDAWIN軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗(yàn)

ELISA檢測過程中會(huì)受到試劑、溫度、儀器靈敏度等因素的影響。為了研究提取溶劑本身對ELISA的影響，比較不同溶劑的回收率。按照“1.4.1”節(jié)方法進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。計(jì)算加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 空白溶劑加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

提取溶劑

（甲醇 ∶ 水）

添加100 ng/kg

AFB1 1 000 ng/kg

AFB1 2 000 ng/kg

AFB1

檢測值

（ng/kg） 回收率

（%） 檢測值

（ng/kg） 回收率

（%） 檢測值

（ng/kg） 回收率

（%）

9 ∶ 1 81.4 81.4 1 178.1 117.8 1 933.7 96.7

8 ∶ 2 82.5 82.5 1 196.3 119.6 1 893.3 94.7

7 ∶ 3 88.7 88.7 967.1 96.7 1 804.3 90.2

6 ∶ 4 109.2 109.2 877.1 87.7 1 780.2 89.0

5 ∶ 5 114.2 114.2 924.5 92.5 2 372.2 118.6

由表2可知，直接用不同溶劑配比進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，不同提取方法的回收率在81.4%～119.6%之間。根據(jù)回收率在70%～120%之間可行，結(jié)果表明，采用上述提取溶劑，并用ELISA檢測是可行的。

2.2 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

苦蕎麥麩中可能含有某些干擾物質(zhì)，對提取效果會(huì)有一定干擾。為了研究樣品中干擾物質(zhì)對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取的影響，按照“1.4.2”節(jié)方法進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值，計(jì)算加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

提取溶劑

（甲醇 ∶ 水） 稀釋10倍后樣品中

AFB1的含量（ng/L）

添加100 ng/L 添加1 500 ng/L 添加5 000 ng/L

檢測值（ng/L） 回收率（%） 檢測值（ng/L） 回收率（%） 檢測值（ng/L） 回收率（%）

9 ∶ 1 101.1 121.1 141.1 703.5 87.06 1 867.2 72.67

8 ∶ 2 139.2 134.2 129.2 687.4 82.37 2 315.8 89.85

7 ∶ 3 117.1 119.9 122.7 637.6 77.21 2 555.4 99.87

6 ∶ 4 102.1 108.1 114.1 735.2 91.22 2 430.9 95.19

5 ∶ 5 135.4 141.0 146.6 572.2 67.27 1 933.7 74.64

由表3可知，在甲醇 ∶ 水比例為9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、5 ∶ 5時(shí)回收率均達(dá)到120%以上，不符合回收率的可行標(biāo)準(zhǔn)[6]，在甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4時(shí)，回收率在91.22%～114.1%之間，最接近100%，回收率最好，即是黃曲霉毒素B1提取時(shí)，提取效果最好。因此宜采用甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4的提取溶劑。

2.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響

不同的料液比對黃曲霉毒素提取有不同影響，選擇甲醇 ∶ 水比例6 ∶ 4為提取溶劑，按照“1.4.3”節(jié)方法進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在料液比為1 g ∶ 5 mL時(shí)，測得的黃曲霉毒素B1的含量最高，表明在料液比為1 g ∶ 5 mL時(shí)，提取液的提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是，當(dāng)料液比大于1 g ∶ 5 mL時(shí)，樣品與溶劑的接觸不夠，不能充分溶解，導(dǎo)致黃曲霉毒素B1提取不完全;當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶ 5 mL時(shí)，正好達(dá)到最佳溶解狀態(tài);當(dāng)料液比小于1 g ∶ 5 mL時(shí)，黃曲霉毒素B1的溶解量減少，導(dǎo)致檢測的含量減少，曲線呈下降趨勢[7]。

2.4 不同超聲時(shí)間對黃曲霉毒素B1提取的影響

采用不同的超聲時(shí)間對黃曲霉毒素B1進(jìn)行提取，按照“1.4.4”節(jié)方法進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值。試驗(yàn)結(jié)果

見圖3。

由圖3可知，在超聲時(shí)間為15 min時(shí)，提取的黃曲霉毒素B1含量最高，即是超聲時(shí)間為15 min時(shí)，黃曲霉毒素B1提取效果最好。當(dāng)超聲時(shí)間低于15 min或高于15 min時(shí)，檢測含量呈緩慢下降的趨勢，即黃曲霉毒素B1提取含量減少。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是在超聲時(shí)間低于15 min時(shí)，超聲強(qiáng)度不夠，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不完全;當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取達(dá)到較為完全的狀態(tài)，含量最高，提取效果最好;當(dāng)提取時(shí)間超過15 min時(shí)，由于苦蕎麥在溶劑中浸泡時(shí)間過久，導(dǎo)致苦蕎麥中黃曲霉毒素B1有少量降解的現(xiàn)象[8]。endprint

2.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響

使用不同的超聲振幅進(jìn)行試驗(yàn)，按照“1.4.5”節(jié)方法進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲振幅的增加黃曲霉毒素B1的含量維持在1 064.6～1 053.7 ng/L之間，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量相對穩(wěn)定。超聲振幅在15Φ時(shí)，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量最高，提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是當(dāng)超聲振幅小于15Φ時(shí)，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不夠充分，造成少量差異;當(dāng)超聲振幅大于15Φ時(shí)，振幅過高造成黃曲霉毒素B1少量降解[9]。

2.6 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗(yàn)

按照“1.4.6”節(jié)方法進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗(yàn)結(jié)果

序號 A：料液比 B：超聲

時(shí)間 C：超聲

振幅 AFB1含量

（ng/L）

1 A1 B1 C1 1 012.5

2 A1 B2 C2 1 037.2

3 A1 B3 C3 1 026.9

4 A2 B1 C2 1 041.2

5 A2 B2 C3 1 060.8

6 A2 B3 C1 1 038.1

7 A3 B1 C3 1 023.1

8 A3 B2 C1 1 051.3

9 A3 B3 C2 1 032.8

k1 1 025.5 1 025.6 1 034.0

k2 1 046.7 1 049.8 1 037.1

k3 1 035.7 1 032.6 1 036.9

R 21.2 24.2 3.1

由表4 分析可知，3種因素對黃曲霉毒素B1提取效果影響大小依次為B>A>C，即超聲時(shí)間>料液比>超聲振幅。根據(jù)正交試驗(yàn)得到黃曲霉毒素B1含量，可以得出最優(yōu)的提取條件為A2B2C2，即料液比為1 g ∶ 5 mL，超聲時(shí)間為 15 min，超聲振幅15Φ。

按照A2B2C2的最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。用ELISA檢測后測得其含量為1 065.1 ng/L。

3 結(jié)論

根據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》、GB/T 18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定》中選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡浔冗M(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在81.4%～119.6%之間，表明采用ELISA檢測黃曲霉毒素B1是可行性。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波提取苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1的最佳工藝條件為溶劑配比6 ∶ 4，料液比為1 g ∶ 5 mL，超聲時(shí)間為15 min，超聲振幅15Φ。在此條件下提取黃曲霉毒素B1的含量為1 065.1 ng/L，高于同等條件下常規(guī)提取含量 1 055.0 ng/L。

此外，苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取方法中因內(nèi)部提取溶劑及外部環(huán)境因素等要求復(fù)雜，影響提取因素多，在實(shí)際工作中還應(yīng)做其他條件的優(yōu)化，如溶劑、溫度、濕度、pH值等，因工作量大而時(shí)間有限，本試驗(yàn)僅對苦蕎麥中黃曲霉毒素B1作初步的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

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