中學(xué)生開(kāi)展DNA“細(xì)”提取的實(shí)踐初探

王天鈺+季欣怡+章熙東

摘 要 以鯽魚(yú)的肌肉、卵和鰓的新鮮冷凍樣品為實(shí)驗(yàn)材料，比較用傳統(tǒng)方法和試劑盒法提取DNA的濃度和純度。結(jié)果表明：從以上三種動(dòng)物不同樣品組織中均能提取到比較純凈完整的基因組DNA（A260/A280在1.8～2.0之間），而且從魚(yú)卵、魚(yú)鰓中提取的全基因組DNA濃度優(yōu)于肌肉，能夠更好的適用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)研究。傳統(tǒng)提取法DNA含量顯著高于試劑盒法。

關(guān)鍵詞 動(dòng)物 基因組DNA 提取

中圖分類號(hào) Q-331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

1 問(wèn)題的提出

在蘇教版生物必修2教材中安排了“DNA粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)，以此加深學(xué)生對(duì)DNA這種細(xì)胞內(nèi)重要有機(jī)物的了解。通過(guò)雞血或香蕉細(xì)胞中DNA的粗提取實(shí)踐，提取到了較多的絮狀物。但對(duì)絮狀物中DNA的含量是多少，老師并為對(duì)此做出講解，由此激發(fā)了我們繼續(xù)的探究欲望，因此繼續(xù)進(jìn)行DNA的細(xì)提取和DNA純度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2 問(wèn)題的解決

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來(lái)，把P（蛋白質(zhì)）除去，再除去細(xì)胞中的糖、RNA及無(wú)機(jī)離子等，從中分離出DNA。制備高純度的DNA溶液是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200 kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)（如PCR）打下基礎(chǔ)。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布和含量不同，要選擇合適的材料和方法提取DNA。DNA的提取方法有多種，比如SDS-蛋白酶K消化法、CTAB法和試劑盒法等。

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)材料：鯽魚(yú)（三種組織：魚(yú)卵、鰓、肌肉）

實(shí)驗(yàn)方法：傳統(tǒng)方法和試劑盒法

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模汉Y選出選取哪一種組織和方法更適合在中學(xué)中開(kāi)展DNA的細(xì)提取實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA提取試劑：ACL細(xì)胞裂解液；蛋白酶K；酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；Tris飽和酚；無(wú)水乙醇；體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液；雙蒸水。

細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒（離心柱型，#GK0122）。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平；高速離心機(jī)（H1202轉(zhuǎn)頭）；微量移液器；恒溫水浴鍋；高壓蒸汽滅菌鍋；純水儀。

超微量DNA分析儀：2000C分光光度計(jì)。

2.4 實(shí)驗(yàn)操作

2.4.1 傳統(tǒng)方法

（1） 取動(dòng)物組織（如魚(yú)的肌肉）約0.15 g于1.5 mL離心管中。

（2） 加入400 μL的ACL細(xì)胞裂解液，將組織剪碎成末，加入蛋白酶K 15 μL，置于55℃水浴消化4 h左右。

（3） 加等體積的Tris-飽和酚（500 μL），混勻4-5 min，12 000 rpm離心5 min（室溫）。

（4） 取上清，放入新1.5 mL離心管中，加等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混勻2 min，12 000 rpm離心5 min。

（5） 取上清，放入2.0 mL離心管中，加2倍體積的-20 ℃無(wú)水乙醇，充分混勻后，-20 ℃放置2 h。

（6） 12 000 rpm離心10 min，棄去上清液（緩慢倒掉即可）。

（7） 加入1 mL 75%的乙醇，洗滌1次，12 000 rpm離心2 min，棄乙醇（緩慢倒掉即可）。

（8） 將離心管倒置干燥30 min。

（9） 加100 μL的雙蒸水溶解DNA，輕彈管壁，65℃溫浴30 min。

2.4.2 試劑盒法（詳見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)）

2.4.3 DNA的濃度和純度檢測(cè)

DNA的純度由260 nm和280 nm處的光吸收（即A260/A280）的比值決定。取DNA溶液1μL，用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DNA用無(wú)菌水溶解后在2000C分光光度計(jì)上測(cè)上述實(shí)驗(yàn)提取到的DNA純度和濃度。結(jié)果如表1所示。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，從以上三種動(dòng)物不同樣品組織中均能提取到比較純凈完整的基因組DNA（A260/A280在1.8～2.00之間），而且從魚(yú)卵、魚(yú)鰓中提取的全基因組DNA濃度優(yōu)于肌肉，能夠較好地適用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)研究。

2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

（1） 實(shí)驗(yàn)所提取到的全基因組DNA包括線粒體中的DNA和細(xì)胞核中的DNA。由于魚(yú)卵的細(xì)胞小于體細(xì)胞，因此同樣重量的魚(yú)卵中所含的細(xì)胞個(gè)數(shù)高于魚(yú)肉細(xì)胞的個(gè)數(shù)，再加上魚(yú)卵細(xì)胞要不斷分裂和生長(zhǎng)需要消耗較多的能量，因此全基因組DNA的含量高于肌肉細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從魚(yú)鰓中提取的全基因組DNA含量高于魚(yú)肉細(xì)胞。查閱資料后推測(cè)鰓是魚(yú)類的呼吸器官，同時(shí)還具有排泄氮代謝廢物和參與滲透壓調(diào)節(jié)的功能，尤其是通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)淖饔脜⑴c滲透壓的調(diào)節(jié)，因此鰓中的線粒體含量較高。另外，鰓中的血管壁很薄，只有單層上皮細(xì)胞。而魚(yú)肉細(xì)胞大都是肌肉細(xì)胞，肌細(xì)胞是多核細(xì)胞，但是肌原纖維的含量非常高。

（2） 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析，得出結(jié)論：從實(shí)驗(yàn)取材的易得性來(lái)看，鯽魚(yú)魚(yú)鰓更適合用于開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)方法和試劑盒法均能提取到較高純度和濃度的DNA，但考慮到中學(xué)生實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的時(shí)間安排，試劑盒法為首選。

2.7 實(shí)驗(yàn)反思

為了順利開(kāi)展探究實(shí)驗(yàn)，需要注意實(shí)驗(yàn)材料的選擇。高中教材中選擇的雞血本應(yīng)是一種理想材料，但對(duì)于學(xué)生而言該試驗(yàn)材料難以獲得、保存條件要求高，實(shí)驗(yàn)室的既有設(shè)備不能很好地滿足這些需求。相比之下，鯽魚(yú)是人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N常見(jiàn)的食材來(lái)源，且動(dòng)物細(xì)胞較植物細(xì)胞少了細(xì)胞壁，更易于釋放細(xì)胞中的DNA。鯽魚(yú)的肌肉、卵、鰓組織材料較易獲取，且來(lái)源豐富，取材后分裝于干凈塑料袋在冰箱中冷凍保存即可，有利于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

DNA的提取是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)，而分子實(shí)驗(yàn)作為生物學(xué)各領(lǐng)域都通用且不可或缺的的分析方法，在高中、大學(xué)甚至更高層次的學(xué)習(xí)都會(huì)涉及，因此為我們實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了豐富的文獻(xiàn)資源。我們對(duì)查閱到的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法做了相應(yīng)的筆記，分析各個(gè)試劑的作用，不同方法的利弊，從而各取所長(zhǎng)，科學(xué)選材，并設(shè)計(jì)出自己的較優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。

在細(xì)提取操作之前，我們實(shí)驗(yàn)組成員先進(jìn)行了高中教材中關(guān)于DNA粗提取和鑒定的實(shí)驗(yàn)，用到的材料有書(shū)本中建議的雞血和香蕉，并對(duì)提取到的絮狀物進(jìn)行了二苯胺的鑒定，觀察到了與教材描述一致的淡藍(lán)色溶液的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)教材實(shí)驗(yàn)的不斷重復(fù)，我們充分了解了提取和鑒定DNA的原理，為細(xì)提取試驗(yàn)中試劑的選擇和使用奠定了理論基礎(chǔ)。

在細(xì)提取實(shí)驗(yàn)中，由于裂解酶等的使用耗時(shí)較長(zhǎng)（傳統(tǒng)耗時(shí)近8 h，試劑盒近3 h），要如何有序進(jìn)行是我們實(shí)驗(yàn)小組必須考慮的問(wèn)題，計(jì)算好每步的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，在不耽誤正常上課的同時(shí)完成實(shí)驗(yàn)是非常有必要的。因此在實(shí)驗(yàn)的前一天就要精心安排好何時(shí)做何事，抓緊課間和午休，做到有條不紊，保證實(shí)驗(yàn)的有序進(jìn)行。

另外，實(shí)驗(yàn)操作中總會(huì)遇到各式問(wèn)題，這就要求我們學(xué)會(huì)自己分析和解決。比如在起初實(shí)驗(yàn)用移液槍吸取蛋白酶K時(shí)，1 mL的蛋白酶K預(yù)計(jì)可以用66次（每次吸取15 μL），結(jié)果10次就用完了，那么問(wèn)題究竟出現(xiàn)在哪里？大家仔細(xì)回憶每次操作，都是按要求調(diào)整了移液槍的容量刻度（15 μL），按道理應(yīng)該沒(méi)有差錯(cuò)的。后來(lái)我們把所有先前在進(jìn)行該步驟時(shí)用到的移液槍刻度調(diào)至15 μL，吸取清水并測(cè)量體積，結(jié)果有一位成員所取清水遠(yuǎn)多于其余成員。觀察后發(fā)現(xiàn)，問(wèn)題出現(xiàn)在選用的移液槍規(guī)格上。該同學(xué)所選用的量程為100～500 μL的移液槍顯示刻度也可以調(diào)至15 μL，但取出的卻仍是量程所規(guī)定最少的100 μL。我們總結(jié)這個(gè)問(wèn)題，移液槍所取試劑體積是由槍內(nèi)彈簧決定的，量程較大者內(nèi)裝彈簧的形變程度也是有限的，所以選取移液槍之前一定要仔細(xì)檢查量程是否符合要求。這同時(shí)也提醒我們，移液槍用完后要調(diào)至最大量程防止彈簧因長(zhǎng)時(shí)間壓縮而產(chǎn)生范性形變。

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