長葉點地梅葉片愈傷組織誘導影響因子分析

摘 要：以長葉點地梅（Androsace longifolia）無菌實生苗為試驗材料，研究植物生長調節劑、大量元素、瓊脂、蔗糖、暗處理等因子對長葉點地梅愈傷組織誘導的影響。結果表明，2，4-D更適合長葉點地梅葉片愈傷的誘導，誘導愈傷組織最適宜的培養基是MS基本培養基附加1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，誘導率為95.0%；暗處理不利于長葉點地梅葉片愈傷的誘導。

關鍵詞：長葉點地梅；愈傷組織誘導；影響因子

中圖分類號：Q813 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.031

Abstract： Taking Androsace longifolia sterile seedlings as experimental materials， the effects of plant growth regulator， macroelement， agar， sugar and dark treatment on Androsace longifolia blade callus induction was studied. The results showed that 2，4-D better suited to Androsace longifolia blade callus induction， the most suitable medium was MS basic medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.2 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar， induction rate was 95.0%； dark treatment was not conducive Androsace leaf callus induction.

Key words： Androsace longifolia； callus induction； impact factor

長葉點地梅（Androsace longifolia） ，為報春花科點地梅屬的多年生草本花卉，生于多石礫的山坡，崗頂和礫石質草原，對生境要求低，適應性強，具有較好的耐踐踏性，是一種良好的園林地被植物。其植株低矮，花朵嬌小，花色清新，東北地區的花期在5月份左右[1]，是該地區難得的早春花卉，具有很高的觀賞價值。據報道點地梅屬植物具有一定藥用價值[2-8] ，可以顯著提高人肝癌細胞抗增殖活性等[9]，長葉點地梅的園林開發應用極少，多處于野生狀態，對其相關研究鮮有報道。目前，對報春花科報春花屬的植物組織培養研究的較多，點地梅屬植物組織培養方面的研究迄今很少。聶勇[10]以點地梅[A.umbellate（Lour.）Merr.]無菌苗的嫩葉為外植體，研究了不同質量濃度下的2，4-D和6-BA對愈傷組織誘導的影響。張彥妮等[11-12]對長葉點地梅愈傷組織的誘導和植株的再生以及細胞懸浮培養的條件進行了研究。但這些文獻均未對長葉點地梅葉片愈傷組織誘導的影響因子進行較為全面的研究。

愈傷組織是指在培養或自然條件下，植物細胞脫分化不斷增殖所產生的主要由薄壁細胞構成的組織。其誘導成功與否影響到組織培養后續的研究。研究表明，愈傷組織的形成除了與創傷有關外，還主要與植物內源或外源的激素有關[13]。因此，在愈傷組織誘導的過程中，植物生長調節劑的種類和濃度最為重要，研究最完善。然而，影響外植體愈傷誘導的因素諸多且少有系統分析，尤其忽略了大量元素、瓊脂濃度、碳源及暗處理等條件在愈傷誘導過程中的影響。本研究探討植物生長調節劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理對長葉點地梅葉片誘導愈傷組織的影響，以期進一步完善長葉點地梅組培快繁技術體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

長葉點地梅無菌實生苗。

1.2 方 法

1.2.1 6-BA 與NAA2，4-D組合對長葉點地梅葉片誘導愈傷的影響 將長葉點地梅無菌實生苗的葉片切成0.5 cm2左右的小塊，接入不同濃度2，4-D和6-BA組合及NAA和6-BA組合的MS培養基（表1）上，每種培養基接種30個外植體。30 d后，統計葉片的誘導率、愈傷的長勢等指標。

1.2.2 大量元素對葉片誘導愈傷的影響 以長葉點地梅葉片為外植體，根據1.2.1試驗結果，確定激素濃度配比，探究大量元素對葉片誘導愈傷的影響，培養基類型分別為MS、1/2MS、1/4MS，每種培養基接種20個外植體，30 d后，統計分析誘導率及愈傷長勢等。

1.2.3 碳源、瓊脂、暗處理對葉片誘導愈傷的影響 以1.2.1與1.2.2結果，確定培養基種類，以長葉點地梅葉片為外植體（20個），比較不同碳源（蔗糖、麥芽糖、葡萄糖）、瓊脂濃度（分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 g·L-1）、暗處理（7，14，21 d）等因素對葉片愈傷誘導的影響，30 d后，統計分析誘導率及愈傷長勢等。

2 結果與分析

2.1 6-BA與 NAA或2，4-D組合對長葉點地梅葉片誘導愈傷的影響

結果表明（圖1），2，4-D與6-BA組合中，在M4的培養基上，葉片誘導愈傷的效果最佳，誘導率高達83.3%；與6-BA組合中，最佳培養基為N3，誘導率為53.3%。當各組合中激素配比相同時，2，4-D和6-BA組合的誘導率均高于NAA和6-BA的組合，這表明，2，4-D提高葉片的愈傷誘導率的效果更佳。此外，在M4與N3的培養基中，愈傷啟動期分別為13，12 d，差距不大；愈傷組織的形態指標相似，均呈淡綠色，結構疏松（圖2，圖3），這表明，兩種培養基均能在較短的時間內得到分化能力較好的愈傷組織。因此，葉片誘導愈傷最佳激素配比為M4，即1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA，與NAA相比，2，4-D更利于長葉點地梅葉片愈傷組織的誘導。

2.2 大量元素對葉片誘導愈傷的影響

大量元素是生物生長所需的必備元素，不同植物對大量元素含量的要求不同，大量元素對葉片誘導愈傷具有重要影響。試驗結果表明，長葉點地梅葉片誘導愈傷的最適培養基為MS（圖4）。隨著大量元素濃度的降低，葉片愈傷組織的誘導率呈下降趨勢。在MS培養基上誘導率達95%，產生的愈傷最多，愈傷組織呈淡綠色，質量大于0.6 g，長勢最好；1/4MS培養基上的葉片愈傷組織誘導率僅為50%，愈傷組織質量小于0.3 g，長勢最差。

2.3 碳源、瓊脂、暗處理對葉片誘導愈傷的影響

培養基中的瓊脂除有固化作用外，也會吸附外植體的代謝產物，因此不同濃度的瓊脂對外植體的生長有不同程度的影響。結果（圖5）表明：瓊脂濃度對誘導率有較大的影響，愈傷組織誘導率在一定瓊脂濃度內升高，當瓊脂濃度達到8.0 g·L-1時，誘導率達到最大值95%。啟動期不受瓊脂濃度的影響，隨著瓊脂濃度變化，葉片愈傷的啟動期均保持在13～15 d。形態指標上，當瓊脂濃度為5.0 g·L-1時，培養基呈半固體狀態，愈傷組織質地疏松，長勢不佳。隨著瓊脂濃度逐漸增加，愈傷組織的長勢越來越好，瓊脂濃度為8.0 g·L-1時，愈傷組織呈淺綠色，長勢最好。當瓊脂濃度為9.0 g·L-1時，愈傷組織顏色加深，質地相對緊實，長勢不佳。這表明瓊脂在高濃度的條件下，培養基硬度加強，不利于外植體對營養物質的吸收。因此，長葉點地梅葉片誘導愈傷最佳瓊脂濃度為8.0 g·L-1。

不同植物材料對碳源的吸收狀況不同，因此對碳源種類的要求也不同。培養基上添加濃度均為3%的麥芽糖、葡萄糖，結果（圖6）發現：蔗糖作為碳源時誘導的愈傷最佳，誘導率達90%，愈傷組織的生長狀況最好，產生愈傷組織較多。誘導率最低的為葡萄糖，產生的愈傷較少。3種碳源的混合效果與單一碳源的作用效果相差不大。在各組合中，愈傷誘導效果最佳的是50%蔗糖與50%麥芽糖混合，誘導率為61.0%，比單一使用麥芽糖、葡萄糖時有較小程度的提高，但低于單獨使用蔗糖時的誘導率，因此長葉點地梅愈傷組織誘導蔗糖為最佳碳源，不宜使用混合碳源。

將外植體進行不同時間的暗處理后發現：暗處理4 d后，葉片開始變黃，暗處理7 d后移至光下培養，光下培養14 d后開始產生愈傷，誘導率僅為5%，愈傷組織呈黃綠色，長勢一般，葉片切口處有褐化發生，且培養基受到褐化物質的污染。葉片在暗處理14 d和21 d后，均無愈傷組織產生，且葉片失綠，外植體變黑褐色死亡。因此，長葉點地梅葉片誘導愈傷時不適合進行暗處理。

3 結論與討論

目前，長葉點地梅在組織培養方面的研究較少，僅局限于生長調節劑的種類及濃度。植物愈傷組織的誘導、增殖及形態建成主要受外植體本身、培養基和培養環境等3大因素的調控[14]，但少有人對其系統地比較研究。本試驗對生長調節劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理對長葉點地梅葉片誘導愈傷組織的影響進行了研究，發現長葉點地梅葉片誘導愈傷的最佳培養基為MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，誘導率達95.0%。一般認為，NAA更利于芽的增值，2，4-D在愈傷組織的誘導過程中較為常用，本研究也得到相似結論，認為2，4-D更適合長葉點地梅葉片誘導愈傷，可以提高愈傷組織誘導率。時永杰等[15]以白羊草（Bothriochloa ischaemum）幼穗為外植體進行組織培養，發現在暗光培養條件下，更利于愈傷組織的產生與生長。本試驗將葉片先進行不同時間的暗處理（7，14，21 d），再置于光下誘導愈傷，結果卻發現，暗處理不利于長葉點地梅葉片對愈傷的誘導。差異的產生可能是由于不同植物材料對光照的要求不同，也體現了本研究對暗處理這一條件探究的意義。

以上研究結果表明，生長調節劑、瓊脂濃度及暗處理，不僅對長葉點地梅葉片誘導愈傷的數量有影響，而且也影響所誘導愈傷的質量。愈傷組織的質量是影響長葉點地梅再生的關鍵性因素，一般情況下，淡綠色疏松的愈傷組織質量較好，分化能力較強，而其他因子只對誘導率即愈傷組織的數量有較大的影響。本研究通過對生長調節劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理等因子影響長葉點地梅葉片誘導愈傷的的探索，為進一步完善長葉點地梅組培快繁體系奠定了基礎。

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