微電場刺激血管內皮細胞培養上清對缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲的影響

張 娟，白 懷，范 平

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072；2.四川大學華西第二醫院西部婦幼醫學研究院，四川 成都 610041)

微電場刺激血管內皮細胞培養上清對缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲的影響

張 娟1，白 懷2，范 平2

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072；2.四川大學華西第二醫院西部婦幼醫學研究院，四川 成都 610041)

目的 探討微電場(electric field，EF)刺激血管內皮細胞培養上清對缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲能力的影響。方法 200 mV/mm微電場刺激血管內皮細胞(HUVEC)5 h，收集培養上清。Transwell 體外侵襲實驗和劃痕實驗觀察EF刺激內皮細胞條件培養基對3% O2物理缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲功能的影響。采用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測 EF刺激的血管內皮細胞條件培養基與滋養細胞共培養24 h后對缺氧培養滋養細胞MMP-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)及MMP-9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)分子表達的影響。結果 Transwell小室體外侵襲實驗和劃痕實驗結果顯示，EF 200 mV/mm 刺激血管內皮細胞5 h條件培養基(conditioned medium，CM)與滋養細胞共培養，可促進缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲功能，其穿膜細胞數目是單純缺氧的3.62倍(P< 0.05)，遷移速度是單純缺氧的1.56倍(P< 0.05)。EF刺激的血管內皮細胞條件培養基與滋養細胞共培養24 h，可以促進缺氧培養滋養細胞的MMP-2表達；對MMP-9分子表達的影響不明顯。結論 EF刺激的血管內皮細胞培養上清能促進缺氧培養滋養細胞的遷移/侵襲能力，可能與內皮細胞作用于滋養細胞、促進MMP-2分子表達增加有關。

直流微電場；缺氧；滋養細胞；內皮細胞；細胞遷移/侵襲

在生理狀態下，妊娠胚胎植入早期絨毛外滋養細胞(extravillous trophoblasts，EVT)侵入蛻膜組織和子宮螺旋動脈，并使后者發生改建變成低阻、高容量血管，維持足夠的母體血液流入絨毛間支持胎盤的功能。滋養細胞適度地侵入子宮內膜是維持妊娠和胎兒發育的前提條件。EVT侵入不足所致的胎盤缺血缺氧，可導致異常產科結局如流產、子癇前期和胎兒宮內生長受限等。Onogi等研究顯示[1]，低氧可抑制妊娠胎盤組織來源的EVT的侵襲功能，并與下調MMP-2分子活性有關。母胎界面滋養細胞功能受到微環境因素的影響，包括血管內皮等因素的作用。我們近年的研究發現[2]，微電場(electric field，EF)可以促進血管內皮細胞分泌血管生成活性因子血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素-8(IL-8)，且這些因子能促進包括滋養細胞在內的多種細胞的遷移等活性[3]。鑒于缺氧環境對滋養細胞的運動活性具有顯著的影響，探討促進這些細胞遷移/侵襲功能具有實際意義。因此，本課題擬觀察EF刺激的血管內皮細胞培養上清是否對缺氧環境的滋養細胞遷移/侵襲功能具有促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 絨毛外滋養細胞HTR-8/SVneo(加拿大Queens University提供)，人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)(英國Aberdeen大學Prof.Min Zhao提供)。醫用高純氮氣(N2)及醫用CO2(四川大學華西第二醫院提供)。Transwell小室(購自Millipore)，細胞培養板(購自Costar)，RPMI-1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶等(購自GIBCO公司)。Matrigel(購自BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 內皮細胞的培養及加電 內皮細胞以DMEM在5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，培養基含有20%的小牛血清、0.04 mmol/L 的谷氨酰胺、青霉素104 U/L、鏈霉素100 mg/L。每次實驗前24 h將凍存的細胞復蘇后以5 ×103個細胞/cm 的密度接種于預制的細胞培養槽中，該培養槽由兩片24 mm ×22 mm、平行放置、相距10 mm的蓋玻片通過硅酮膠(Dow Corning)固定于100 mm ×20 mm 的組織培養皿的底面而形成一個兩端開放的細胞培養小室。對培養小室內細胞電場刺激5 h后，收集培養上清。

1.2.2 Transwell體外侵襲實驗 用無血清1640以1∶3 比例稀釋Matrigel(10 mg/L)后包被基底膜，放入37 ℃培養箱孵育至少半小時。取生長融合至80%的HTR-8/SVneo細胞，加入不含胎牛血清的1640培養基，37 ℃、5%CO2靜置培養12 h，消化細胞后用無血清培養基重懸，調整細胞密度至(7～8)×105/ml，無菌條件下取出Millicell-插入小室，放進無菌24孔培養板中。在24孔板中分別加入600 μl 預熱的HUVEC加電和對照組的上清。取細胞懸液300 μl，加入包被好的Transwell上室。將加好細胞懸液的培養板分別放入正常培養狀態(5%CO2，95% O2)和缺氧狀態(5%CO2，3% O2，92% N2)培養細胞，均培養90 h。然后取出插入小室，用棉簽輕輕拭去上室濾膜內面的基質膠和細胞，將整個插入小室放進24孔板中，95%酒精固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，計數穿過膜的細胞數，整個實驗重復3次。

1.2.3 劃痕實驗 用記號筆在6孔板背后用直尺比著，均勻劃橫線。在孔中加入約5×105個細胞，過夜培養。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用預熱的PBS清洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后分別加入無血清培養基作為對照組和條件培養基作為實驗組，放入培養箱缺氧狀態(5%CO2，3% O2，92% N2)分別培養24 h和30 h，拍照記錄。

1.2.4 Western-blot及 RT-PCR Western-blot檢測采用常規方法，收集細胞，用RIPA裂解細胞提取總蛋白質，確定點樣量，經SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉移至硝酸纖維素膜。分別與MMP2、MMP9、GAPDH蛋白抗體及二抗反應后化學發光顯色，陽性條帶以凝膠吸光度分析軟件測定積分吸光度值為其蛋白量。RT-PCR按常規方法提取RNA再逆轉錄。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗和方差分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EF刺激HUVEC的條件培養基促進缺氧培養滋養細胞的遷移功能 劃痕實驗結果顯示，對照組細胞和實驗組細胞均在缺氧條件下培養，培養24小時后，實驗組細胞向劃痕處遷移生長的細胞數目明顯多于對照組，30小時后幾乎布滿劃痕位置，遷移速度是單純缺氧條件遷移速度的1.56倍。見圖1。

圖1 EF刺激的血管內皮細胞培養上清促進缺氧滋養細胞的遷移(Bar=100 μm)

2.2 EF刺激HUVEC的條件培養基促進缺氧培養滋養細胞的侵襲功能 Transwell小室侵襲實驗結果顯示，EF(200mV/mm)刺激血管內皮細胞5 h條件培養基與滋養細胞共培養，可以促進缺氧培養條件滋養細胞的穿膜(侵襲)功能(穿膜細胞數是單純缺氧條件穿膜細胞數的3.62倍)，而單純缺氧條件滋養細胞的穿膜數目較正常氧環境培養細胞顯著降低，見圖2。

圖2 EF刺激的血管內皮細胞培養上清促進滋養細胞的侵襲力(Transwell實驗，Bar=100 μm)

2.3 微電場刺激HUVEC的條件培養基對缺氧培養滋養細胞遷移/侵襲相關分子MMP-2和MMP-9表達的影響 Western blot結果顯示，上述EF刺激的血管內皮細胞條件培養基與滋養細胞共培養24 h，可以促進缺氧培養條件(3% O2)滋養細胞的MMP-2的表達，而單純缺氧培養滋養細胞MMP-2表達較正常氧環境培養細胞的表達顯著降低，但對MMP-9分子表達的影響不明顯。熒光定量PCR法對mRNA水平的分析結果與上述蛋白水平的結果一致，見圖3、圖4。

圖3 EF刺激血管內皮細胞培養上清促進滋養細胞MMP-2的表達

圖4 EF刺激血管內皮細胞培養上清對MMP-9表達的影響

3 討論

孕早期EF適度地侵入子宮內膜，在母胎循環的建立及成功妊娠方面發揮關鍵作用。EVT侵入不足可能導致流產、子癇前期和胎兒宮內生長受限等產科不良結局。在生理狀態下，妊娠早期(前三個月)胎盤和胚胎均處于低O2分壓的環境。研究發現在孕11周之前胎盤氧分壓低于蛻膜氧分壓[4，5]。大約孕12周胎盤氧分壓才與蛻膜氧分壓相同[4，5]，胎盤氧分壓與孕周之間存在正相關關系。因此，缺氧可能在正常和病理性妊娠過程中胎盤形成及其功能調節方面起重要作用。

缺氧環境對滋養細胞侵襲/遷移的影響存在廣泛的爭論。一些研究結果顯示，缺氧對滋養細胞侵襲功能產生促進作用，例如，Lash 等研究發現，與20%氧環境結果比較，缺氧(1%O2)培養的HTR-8/SVneo 24 h，促進細胞的侵襲能力[6]，而Kilburn等的研究發現，滋養細胞HTR-8/ SVneo在缺氧(2% O2)培養72 h，其侵襲能力降低[7]；另一項類似研究顯示，JEG-3和HTR-8/SVneo在缺氧(2% O2)培養24 h，其侵襲活性增強，但培養72 h其侵襲能力降低。本研究發現，3% O2環境中滋養細胞HTR-8/SVneo培養90 h其侵襲能力受到抑制，與Kilburn等[7]的結果一致。關于這些研究結果不一致的原因，可能與細胞種類、培養方法如缺氧時間及程度的不同等有關。

滋養細胞的生物學行為受局部環境眾多因素的影響，包括血管內皮細胞等因素的作用。我們前期研究發現EF可以促進血管內皮細胞分泌血管生成活性因子VEGF和IL-8[3]，這些因子是促進細胞遷移的重要活性分子。我們推測，這些活性分子對滋養細胞功能、特別是缺氧環境中滋養細胞侵襲/遷移功能可能具有影響。本研究結果顯示，EF刺激血管內皮細胞5 h的條件培養基與缺氧環境滋養細胞共培養90 h，可明顯促進其穿膜的能力：與對照培養細胞相比，穿膜細胞計數是單純缺氧培養的3.62倍，遷移速度是單純缺氧培養的1.56倍，提示血管內皮細胞來源的旁分泌因子可能對缺氧滋養細胞的侵襲功能起促進作用。

本研究還發現，3% O2的缺氧環境培養滋養細胞MMP-2的表達降低，與Onogi等[1]的研究結果一致，但對MMP-9的表達影響不明顯，與張雅琪等[8～10]的報道不一致，可能與缺氧條件、缺氧時間及滋養細胞種類不同有關。本研究顯示，EF刺激血管內皮細胞的條件培養基促進滋養細胞的侵襲功能可能與其上調MMP-2的表達有關。

上述結果提示，EF刺激的血管內皮細胞培養上清能促進缺氧滋養細胞的遷移/侵襲能力，可能與內皮細胞分泌的相關活性分子如VEGF和 IL-8等作用于滋養細胞、促進MMP-2分子表達增加有關。

[1] Onogi A，Naruse K，Sado T，et al.Kobayashi.Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase(MMP)-2 activation in the early first trimester of human Pregnancy[J].Placenta，2011，32：665-670.

[2] Juan Z，Rongmei R，Xuefeng L，et al.A small physiological electric field mediated responses of extravillous trophoblasts derived from HTR8/SVneo cells：Involvement of Activation of Focal Adhesion Kinase Signaling[J].PLOS ONE，2014，3(9)：e92252.

[3] Bai H，Forrester JV，Zhao M.DC electric stimulation upregulates angiogenicfactors in endothelial cells through activation of VEGF receptors[J].Cytokine，2011，55(1)：110-115.

[4] Jiang R，Cai J，Zhu Z，et al.Hypoxic trophoblast HMGB1 induces endothelial cell hyperpermeability via the TRL-4/caveolin-1 pathway[J].J Immunol，2014，193(10)：5000-5012.

[5] Sánchez-Aranguren LC，Prada CE，Ria o-Medina CE，et al.Endothelial dysfunction and preeclampsia：role of oxidative stress[J].Front Physiol，2014，5：372.

[6] Lash GE，Hornbuckle J，Brunt A，et al.Effect of low oxygen concentrations on trophoblast-like cell line invasion[J].Placenta，2007，28：390-398.

[7] Kilburn BA，Wang J，Duniec-Dmuchkowski ZM，et al.Extracellular matrix composition and hypoxia regulate the expression of HLA-G and integrins in a human trophoblast cell line[J].Biol Repro，2000，62：739-747.

[8] 張雅琪，吳媛媛，劉海意，等.缺氧調控滋養細胞MMP-9/TIMP-1 表達及侵襲能力的體外研究[J].現代婦產科進展，2014，23(2)：117-120.

[9] Li G，Zhang Y，Qian Y，et al.Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP-2 and MMP-9 expression through NF-KB/HIF-1 A pathway[J].Mol Immunol，2013，53(3)：227-236.

國家自然科學基金資助項目(編號：30872774/H0418)；四川省衛生和計劃生育委員會科研基金資助項目(編號：140071)

R446.11

A

1672-6170(2015)05-0069-04

2015-04-30；

2015-06-20)