在位子宮內膜神經生長因子在子宮內膜異位癥中的表達及其臨床意義

潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學華西第二醫院，四川 成都 610041)

在位子宮內膜神經生長因子在子宮內膜異位癥中的表達及其臨床意義

潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學華西第二醫院，四川 成都 610041)

目的 探討在位子宮內膜神經生長因子(nerve growth factor，NGF)在子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)中的表達及其臨床意義。方法 選擇2013年9 月至2014年3月在四川大學華西第二醫院行手術治療的EMS患者39例(A組)，其中疼痛22例(A1組)，無疼痛17例(A2組)。選擇同期因宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)III行子宮切除的24例患者作為對照(B組)。采用免疫組化法檢測各組子宮在位內膜中NGF的表達。結果 NGF在A組及B組在位子宮內膜上均有陽性表達，但A組、A1組NGF的表達均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組表達明顯高于A2組(P< 0.05)，而A2與B組比較表達差異無統計學意義(P> 0.05)。結論 EMS患者在位子宮內膜 NGF表達增加，伴有疼痛者更明顯。NGF可能參與了EMS疼痛的發生。

子宮內膜異位癥；神經生長因子；疼痛

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)簡稱內異癥，是子宮外含有子宮內膜腺體和基質的雌激素依賴性病變，始于細胞水平而止于盆腔疼痛和不孕[1]。80%的EMS患者有慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)，主要表現為經期或經前后出現的腹痛、腰骶部疼痛，甚至劇痛難忍，嚴重影響患者生活質量和身心健康。EMS的發病機制至今尚不明確。近年來，越來越多的研究顯示EMS疼痛與在位內膜神經纖維密度有關。神經營養因子(neurotrophin，NT)在誘導及維持神經纖維生長中起著重要的作用，而其中的在位子宮內膜神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是產生疼痛及痛覺過敏的關鍵因素[2]，由此推測NGF可能與EMS患者的疼痛有關。本研究擬通過免疫組化法檢測NGF在EMS在位內膜的表達，了解其在EMS疼痛發生中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年9月至2014年3月在四川大學華西第二醫院經手術病理證實為EMS且同意術中同時行診刮術的39例患者(A組)，其中疼痛22例(A1組)和無疼痛17例(A2組)，A1組年齡22～49歲[(34.3±4.1)歲]，A2組年齡24～47歲[(35.7±6.3歲))。選擇同期因CINIII行子宮切除的24例患者作為對照(B組)，年齡20～45歲[(31.3±5.1歲)]。A組排除子宮腺肌癥和術前3月內接受過激素治療的患者，B組排除EMS、子宮腺肌癥和術前3月內接受過激素治療的患者。A1、A2和B組在孕產次、年齡、月經周期等方面比較成差異均無統計學意義(P> 0.05)，A1組和A2組在手術分期分布上差異無統計學意義(P> 0.05)。

1.2 方法 分別提取病例組在位內膜組織和對照組在位內膜組織的石蠟切片，制成4 μm厚切片。采用免疫組化辣根過氧化物酶(HRP)-二甲基聯苯胺(DAB)檢測顯示系統分析A，B兩組中NGF的表達情況。試劑一抗多克隆兔抗人NGF抗體(工作濃度1∶100)購自北京希美杰生物技術有限公司。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。用小鼠腦組織作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。用倒置生物顯微鏡觀察切片，并對圖像進行采集。

1.3 結果判定 參照Shimizu等[3]的免疫組化評分方法，進行半定量評分。顯微鏡下隨機計數5個高倍視野(×200)，綜合細胞染色強度及陽性細胞占總細胞數的百分比，進行半定量分析。染色強度評分標準：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，5%～為1分，25%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。每張切片讀取5個視野的平均值，將細胞染色強度計分和陽性細胞比例計分相加，作為最后積分。根據最后積分，≤1分為陰性(-)，>1分且≤3分為弱陽性(+)，>3分且≤5分為陽性(++)，>5分為強陽性(+++)。EMS手術分期參照美國生育協會提出的“修正子宮內膜異位癥分期法(1997年)”。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

NGF在A組及B組在位子宮內膜上均有不同程度表達。陽性顆粒主要定位于子宮內膜腺上皮細胞的胞漿和胞膜。A組、A1組、A2組和B組NGF表達陽性率分別為76.9%、95.5%、52.9%和45.8%，其中A組、A1組均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組明顯高于A2組(P< 0.05)。A2與B組比較差異無統計學意義(P> 0.05)，見表1及圖1。

表1 不同分組NGF的表達

#A組與B組比較；## A1組與B組比較；### A1組與A2組比較；#### A2組與B組比較

3 討論

EMS病因復雜，發病機制尚不清楚，目前推測神經機制可能在其發病中起著重要作用[4]。有研究顯示內異癥是一種混合炎癥、神經性疼痛的病癥[5]。Stratton 等[6]通過電子數據庫檢索1967年后報道的疼痛婦女的臨床基礎研究發現：內膜異位病灶可以誘發自己的神經支配，從而產生病變與中樞神經系統之間的直接和雙向互動聯系。

圖1 NGF在子宮內膜的表達情況(DAB×200) a：NGF陰性表達；b：NGF弱陽性表達；c：NGF陽性表達；d：NGF強陽性表達

NT是一類由神經所支配的組織(如肌肉)和星形膠質細胞產生的且為神經元生長與存活所必需的蛋白質分子，對神經元的發育、存活和凋亡起重要作用。其中NGF是最早發現的神經因子，在神經纖維的生長、維持中起著重要作用。正常人的子宮肌層、子宮內膜與子宮肌層交界面及子宮內膜基底層的深部都有神經纖維支配，但子宮內膜的上2/3無神經纖維[7]。

EMS患者病灶內的高神經纖維分布與其神經因子高表達相伴出現。McKinnon 等[8]檢測了EMS患者異位組織神經纖維及腹腔液神經因子濃度，結果顯示與EMS相關的疼痛和腹腔液神經因子的濃度有關。Barcena[9]進行神經營養因子的前瞻性臨床研究，比較了EMS、子宮腺肌病、盆腔粘連患者腹腔液中神經生長因子(NGF)、腦源性神經因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經營養因子3(Neurotrophin-3，NT-3)的濃度，發現內異癥患者腹腔液中NGF、BDNF的濃度明顯升高。Kajitani等[10]通過測定EMS患者與非EMS患者腹腔液中NGF的表達，發現EMS患者腹腔液中的NGF表達水平顯著高于常人水平。

我們研究了NGF因子在EMS與非EMS患者在位子宮內膜上的表達，結果顯示：NGF在EMS患者在位內膜的表達明顯高于對照組，差異有統計學意義。其中又尤以在EMS疼痛患者在位內膜中的表達最高，高達95.5%，其明顯高于非疼痛組及對照組，差異均有統計學意義。非疼痛組與對照組相比，NGF表達略高，但差異無統計學意義，提示NGF主要通過參與EMS的疼痛而參與EMS的發生。

NGF參與EMS疼痛發生的神經機制可能與下列因素有關：NGF及其受體增加能促進感覺神經纖維的增生。Arnold[11]報道內異癥腹膜病灶中交感神經纖維密度降低而感覺神經纖維密度增加。Bokor等[12]研究顯示：小神經纖維的密度在輕度子宮內膜異位患者的子宮內膜中與正常盆腔的患者相比高出14倍。NGF本身亦是一種疼痛介質，能誘導與調控與中樞疼痛傳導有關的P物質(Substance P，SP)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)及神經絲(neurofilament，NF)的表達。腎上腺能神經末梢釋放前列腺素E2，前列環素(prostacyclin，PGI2)，這些物質能使感覺神經C致敏[13]。作為重要的前列腺素合成限速酶的環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)能增加侵襲性、誘導血管形成，在內膜異位癥患者的在位內膜，其表達亦明顯增高，使之有助于內膜細胞的粘附侵襲。這也符合我國學者提出的“在位內膜決定論”。而EMS患者病灶中的神經纖維可能即來源于在位內膜功能層的神經纖維，或是有活性的在位內膜脫落后，種植在腹腔等其他部位時所分泌的能促進神經生長的細胞因子如NGF。EMS腺體和血管附近有神經生長因子受體p75(NGFRp75)陽性的神經纖維表達，神經生長因子通過EMS腺體產生免疫反應[14]。這提示腹膜子宮內膜異位病灶可能受感覺神經A、感覺神經C、膽堿能和腎上腺素能神經纖維支配。Barcena de Arellano等[15]比較EMS患者與其他婦科患者的腹腔液神經元生長的體外模型和NGF的表達，發現EMS和子宮內膜異位病灶的腹腔液具有親神經性。EMS是激素依耐性疾病，雌二醇和孕激素均能刺激NGF在間質細胞的表達，而使用孕激素后，NGF受體則明顯減弱[16]。

本研究發現在EMS在位內膜中有NGF表達，且疼痛患者中表達更顯著，提示NGF可能參與了EMS疼痛的發生。由此說明采用在位內膜免疫組化標記NGF作為具有疼痛的EMS患者的篩查以及采用神經因子拮抗阻斷治療EMS疼痛患者將是可行的。

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The expression of nerve growth factor and its significance in eutopic endometrium of patients with endometriosis

PAN Hai-ying，WANG Hong-jing，XU Pan，YANG Ling-yun，JIA Xi-biao，CHEN Jing，CHEN Cen

(West China Second Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

WANGHong-jing

Objective To investigate the expression of nerve growth factor(NGF)in eutopic endometrium of patients with endometriosis，and to explore the role of NGF in the development of endometriosis-associated pain.Methods A total of 63 patients underwent surgical were studied.Of these patients，39 underwent surgical endometriosis lesion excision(group A)in which 22 patients suffered from dysmenorrheal(group A1)and 17 patients had no dysmenorrheal(group A2).At the same time，24 patients undergone uterectomy because of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)were used as control group(group B).Immunohistochemistry was performed to detect the expression of NGF in eutopic endometrium.Results The level of NGF of endometrium in the group A and the group A1 were significantly higher than that in the group B(P< 0.05).The level of NGF in endometrium in the group A1 was significantly higher than that in the group A2(P< 0.05).There was no statistically significant difference in NGF expression between the group A2 and group B(P> 0.05).Conclusion NGF express in endometrium of patients with dysmenorrhea may participate in the pathogenesis of endometriosis and endometriosis associated pain.

Endometriosis；Nerve growth factor；Dysmenorrhea

四川省科技廳科技支撐基金資助項目(編號：2012 SZ0022)

王紅靜

R711.71

A

1672-6170(2015)05-0111-03

2015-01-30；

2015-05-27)