基于彌散圓的光學顯微鏡景深自動標定方法

崔 力，李長陽

（寧波大學 信息科學與工程學院，浙江 寧波 315211）

基于彌散圓的光學顯微鏡景深自動標定方法

崔 力，李長陽

（寧波大學 信息科學與工程學院，浙江 寧波 315211）

針對光學顯微鏡存在小景深且景深范圍不易確定的缺陷，導致后續圖像處理工作困難這一問題，提出了一種基于彌散圓的光學顯微鏡景深自動標定方法。控制步進電機z軸方向移動連續拍攝，保證載物臺上圓點標定板從前離焦到后離焦定向移動；利用活動輪廓分割方法提取圖片序列中的輪廓圓，再采用LBP算法對拍攝圖片序列進行復合輪廓處理和跟蹤；根據提出的算法統計圖像序列中標定圓輪廓的真圓度與彌散圓面積數據并分析標定景深。理論表明，提出的算法可以在不同倍率下測定景深范圍，實驗結果證明，該算法可以根據序列圖片較為有效地標定景深，對后續圖像處理有重要意義。

景深；活動輪廓；LBP；真圓度；彌散圓

0 引言

視覺系統可應用于自動化的檢測、測量以及控制。但這些操作精準的前提是建立在鏡頭景深范圍內［1］。景深與光學成像有關。在理想化的射線光學中，每條射線收斂到一個點時為聚焦狀態，實際中成像由于衍射和畸變會產生軟邊緣的模糊光斑，邊緣分割的不穩定導致景深范圍不易確定［2］。實際在固定焦距的條件下不同物距仍然可以出現清晰成像效果，清晰成像的距離范圍稱為景深（Depth-of-Field，DOF）。人們對景深有過初步的探討，提到了一些方法近似估計景深或處理景深問題，然而更傾向于換一種思路解決景深問題。例如，“改進微透鏡”、編碼相機［3］、寬動態［4］、去模糊算法［5］等等。在醫療、工業、或是生物醫學領域，景深對于觀察觀測都有著極大的影響［6，7］，但是在當前工業中，景深的測量大多選擇人工干預或者更換器物的方式替代景深約束（如停留于人眼標定，或者用激光灰度掃描景深標定版進行標定），缺乏價格低廉的景深自動標定方法。

活動輪廓就是一種基于能量的圖像分割方法，對特征描述、識別和理解等高層次的處理有著重大的影響［8］。利用能量密集度的活動輪廓模型定位COC邊緣，使用LBP分割跟蹤COC邊緣，并LBP是機器視覺領域的一種分類特征，該算子對光照具有不變性，能夠較好的提取出圓擴散失真的邊緣，提升檢測效果［9］。彌散圓（Circle of Confusion，COC）用于描述一個點與一個最大模糊光斑點的區別。因為其以能量擴散為表現形式，通過評價“最大容忍彌散圓”可以間接反映景深信息。所以，根據COC直徑標定景深具有可行性。

1 光學顯微鏡景深自動標定方法

光學鏡片都存在景深的限制。如圖1所示，以一個矩形范圍做景深示意圖（實際情況略有不同）。調整顯微鏡物距可在景深范圍內觀測到清晰的物像，反之則是離焦模糊的圖像。由此現象，控制步進電機從前離焦到后離焦等間隔連續拍攝，再根據本文活動輪廓及LBP分割跟蹤算法得到序列圖像的相關參數，即可由COC真圓度和COC面積自動標定出景深范圍。

圖1 顯微鏡平臺組成示意圖

1.1 算法設計

針對不同光照環境及震動噪聲等等對于圖片拍攝的影響，本文選取了基于能量的活動輪廓分割以及具有光照魯棒性的LBP分割方法提取標定輪廓。算法流程如圖2所示。

圖2 DOF標定算法流程圖

首先，選取圓點標定版，將其固定在顯微鏡載物臺上，利用步進電機單向步進移動并連續拍攝標定圖片序列；然后，對序列圖片進行活動輪廓分割，并且用LBP做分割跟蹤處理，統計標定參數列表；最后，根據參數列表，進行多閾值分析，判斷標定圖片序列輪廓的真圓度和COC面積，得到滿足Ts（Ts＝Sbest－SL1＝Sbest－SL2）以及Δρ（真圓度偏差）的位置，L1，L2為臨界閾值序列標簽，通過計算可得到DOF。

1.2 活動輪廓

活動輪廓算法是一種基于能量的分割算法，對輪廓進行迭代運算，可以彌補光暈產生的毛刺干擾，更為精準的定位COC范圍。簡單的Sobel和Canny等邊緣檢測算子對能量信息不夠敏感，而活動輪廓利用能量估計函數進行邊界測定，保證了邊界的穩定性。根據文獻［10］中的全局能量擬合模型可見式（1）：

式中，outside（C1）與inside（C1）分別代表區域輪廓C1的內外邊界。c1、c2是圖像的2個亮度常量估計參數。式（1）的v｜C1｜為一個過擬合平滑約束的正則項，最終根據迭代得到標定圓的相應輪廓C1如圖3所示。其中，圖3（a）為經過1000次迭代后的最終邊界輪廓收斂示意圖；圖3（b）為活動輪廓水平集的三維示意圖，其x和y軸分布為圖像的長寬，z軸為圖像灰度反色歸一化到區間（－50，50）的灰度圖，并以顏色區分灰度值。

圖3 基于能量的活動輪廓處理圖

1.3 LBP分割

LBP模型為式（2）：

式中，（xc，yc）是中心像素，ic為亮度，ip是相鄰像素的亮度。s（x）是一個符號函數，函數形式如式（3）：

LBP的基本思想是對圖像當前像素和它鄰域像素進行對比后的結果求和。以當前像素為中心，對相鄰像素進行閾值比較，如果中心像素的亮度大于或等于相鄰像素，則標記為“1”，否則標記為“0”。用二進制數字來表示每個像素，例如00011110。由于周圍相鄰8個像素，最終可能獲取28個組合，該組合被稱為局部二值模式，有時也稱為LBP碼。利用LBP抗光照干擾特性，對一些內部圓干擾進行圖像處理，通過如下方式計算：

①將檢測窗口切分為區塊（cells，每個區塊3x3像素）；

②區塊中的每個像素，與其八鄰域像素按照順時針的順序進行比較（左上、左中、左下、右上等）；

③中心像素大于某個鄰域的，設置為1；否則，設置為0。最終獲得一個8位的二進制數（通常情況下會轉換為十進制數字），作為該位置的特征。

根據活動輪廓得到的輪廓C1，計算邊界點的Manhattan距離DM作為初步計算：

再根據候選外邊界點在各個方向出現的概率與內邊界點q在鄰域位置序列上對應值Dirq，對p、q兩點的距離DM作出相應修正，如式（5）所示：

候選外邊界點方向權值計算公式如式（6）：

式中，Dir是位置序列，以中心像素左上方為起點按順時針走向8鄰域計算方向權重。再根據C1和相應的權重計算內輪廓跟蹤方向，得到相應輪廓C。圖4為LBP分割跟蹤處理圖。

圖4 LBP處理圖

1.4 統計劃分與景深計算

步進電機移動的過程中，因為精度問題，導致拍攝圓形標定板的定向漂移現象發生，所以文中選取單個圓形標定區域進行序列跟蹤計算。由輪廓跟蹤序列，對標定圖像序列圓輪廓進行參數統計，進行真圓度分析與COC測定，再標定景深。景深與COC關系如圖5所示，其中，δ為COC的直徑。

圖5 景深與COC的關系

根據景深的定義將景深計算問題轉換成COC估計，以COC面積Sl作為一個全局能量約束，同時聯合真圓度約束。由輪廓跟蹤得到COC邊界C，然后由C的圖像空間信息計算出圓心Oi，再根據圓心Oi計算出序列圖像的真圓度ρ，真圓度計算公式為：

式中，Rmax為以Oi為圓心輪廓Ci的最大圓半徑；Rmin以Oi為圓心輪廓Ci的最小圓半徑；Ri為周長Ci＝2 π R得到不同圖像序列統計半徑，ρ越接近1表示越接近解析圓。設定閾值Δρ＝0.85作為初始約束統計粗景深范圍D1，再根據COC面積界限Ts進行二次約束，計算COC圖像序列模糊邊界標簽L1與L2。其中，Ts為最大容忍COC面積Si與聚焦平面圓點面積Sbest的差值。最終，可以根據Ts對應的模糊邊界標簽值L1與L2以及步進長度s計算精景深范圍D。

2 實驗與結果分析

2.1 實驗裝置與設計

實驗平臺采用南京波長光電科技有限公司的ZOOM460N體視顯微鏡，載物臺上放置一塊圓點標定板，通過光路公用的物鏡傳送信息至頂部目鏡；目鏡直接通過轉接口連接到由日本Watec公司生產的兩個型號為902B攝像機，再通過USB采樣得到每幀704×576大小的圖像。

實驗整體設計：利用圓點標定板，做單向等距移動拍攝，得到標定圖片序列（實驗中，拍攝了150張6 μm／step的圖像序列），再對圖像序列進行活動輪廓分割，并進行LBP分割跟蹤，得到分析數據Rmax、Rmin、Ri與ρ。根據Δρ和Ts計算景深范圍D。

2.2 結果分析

活動輪廓選用基于全局的能量分析，初始輪廓的選定不會對最終的收斂結果有較大影響，只會造成分割能量平衡時迭代終止次數不同，越接近實際輪廓的初始輪廓算法迭代次數越少。實驗中選用了800次迭代為終止條件，圖6（a）為輸入圖像；圖6（b）為50次迭代步長的活動輪廓過程示意圖；圖6（c）為LBP分割跟蹤邊界。根據圖6（c）輪廓得到相應序列圖片統計，如表1所示。

圖6 單個標定圓的處理圖

表1 標定參數統計

表1中，L為對應的步進高度標簽，ρ為不同L對應的輪廓真圓度，Ri為標定圓半徑，Si為標定圓面積，Ci為標定圓輪廓長度，ρ＞Δρ與Si＞Ts標記為“1”，代表滿足條件ρ＞0.85與Si＞Ts時的圖像（若觀測平臺成像面與光軸的垂直度較高，可以提高真圓度ρ作為閾值限定），反之，標記為“0”。由COC直徑定義，選取經驗值δ＝0.1pixel為最大允許的模糊直徑，根據數據提取Rmax＝17.316 1與圓面積公式Ts＝π（Rmax－δ）2計算得到景深DOF的界限閾值Ts＝931，即可利用式（8）計算景深；

其中，L1＝114，L2＝102，s為步進電機每次拍攝垂直方向的移動步長，測試環境中s＝6 μm，得到景深D＝72 μm。在Matlab測試平臺下局部區域處理效果圖如圖7所示。圖7（a）的橫坐標是圖像序列標簽，縱坐標為真圓度數據，根據原始數據可得到其趨勢線擬合二次方程為：y＝－0．000 04x2＋0．007 6x＋0.485 7，對應的相關系數R2＝0.504 5；圖7（b）的橫坐標也是圖像序列標簽，縱坐標為COC面積Si數據，根據原始數據可得到其趨勢線擬合二次方程為：y＝－0．499x2＋10．864x＋343．96，對應的相關系數R2＝0.886 3。根據表1與圖7擬合曲線方程分析可知：在當前實驗平臺下，震動移位干擾比較大，活動輪廓分割與LBP跟蹤得到的輪廓不呈現光滑曲線的特性，但是真圓度ρ和COC面積Si變化大體趨勢為二次曲線模型，證明提出算法的景深標定具有合理性。

圖7 數據統計擬合圖

3 結束語

針對光學顯微鏡存在小景深且景深范圍不易測定的問題出發，提出了一種基于能量的活動輪廓與LBP分割跟蹤COC邊界的光學顯微鏡景深標定方法，根據跟蹤得到的統計真圓度ρ和COC的面積Si數據進行DOF標定，最后，在實驗平臺下根據本文算法可測得DOF為72 μm。理論推導表明，所提出的算法適用于不同倍率下景深范圍測定，實驗結果分析證明，根據真圓度ρ與COC面積判定景深范圍具有科學性，而且標定過程中只需要步進電機等間距定向移動拍攝，即可通過提出的算法有效的自動測量景深范圍，對后續圖像處理有重要意義。

［1］Hartley R，Zisserman A.Multiple View Geometry in Com-puter Vision［J］.Robotica，2005，23（2）：271－271.

［2］Taylor B N，Beidler K V，Strand A E，et al.Improved Scal-ing of Minirhizotron Data using an Empirically-derived Depth of Field and Correcting for the Underestimation of Root Diameters［J］.Plant and Soil，2014，374（1－2）：941－948.

［3］Fleischmann O，Koch R.Lens-Based Depth Estimation for Multi-focusPlenopticCameras［M］∥Pattern Recognition.SpringerInternationalPublishing，2014：410－420.

［4］Gangopadhyay S，Lee Y，Bin Nasir S，et al.Modeling and Analysis ofDigitalLinearDropoutRegulatorswith Adaptive Control for High Efficiency under Wide Dynamic Range Digital Loads［C］∥Design，Automation and Test in Europe Conference and Exhibition（DATE），2014. IEEE，2014：1－6.

［5］Lee I，Mahmood M T，Choi T S.Adaptive Window Selection for 3D Shape Recovery from Image Focus［J］. Optics＆Laser Technology，2013，45：21－31.

［6］Dutta S，Pal S K，Mukhopadhyay S，et al.Application of Digital Image Processing in Tool Condition Monitoring：A review［J］.CIRP Journal of Manufacturing Science and Technology，2013，6（3）：212－232.

［7］Zheng G，Horstmeyer R，Yang C.Wide-field，High-resolution Fourier Ptychographic microscopy［J］.Nature photonics，2013，7（9）：739－745.

［8］Khan M F，Khan E，Abbasi Z A.Segment Selective Dynamic Histogram Equalization for Brightness Preserving Contrast Enhancement of Images［J］.Optik-International Journal for Light and Electron Optics，2014，125（3）：1385－1389.

［9］Kellokumpu V，Zhao G，Pietik?inen M.Recognition of Human Actions Using Texture Descriptors［J］.Machine Vision and Applications，2011，22（5）：767－780.

［10］Chan T F，Vese L.Active Contours without Edges［J］. IEEE Transactions on Image Processing，2001，10（2）：266－277.

Depth-of-Field Automatic Calibration of Optical Microscope Based on LBP

CUI Li，LI Chang-yang
（Faculty of Information Science and Engineering，Ningbo University，Ningbo Zhejiang 315211，China）

As small DOF of optical microscope，the unsharpness is imperceptible under normal viewing conditions.In response to this issue，an optical microscope automatic calibration method is proposed to measure DOF.The proposed method is based on the convex active contour model and LBP algorithm which is easy to work.Additionally，the proposed method provides lower cost than other methods.Firstly，spot calibrate board is fixed on the working stage controlled by the stepper motor，and the sequence images is captured by moving along z-axis from the front of DOF to the back of DOF equidistantly.Secondly，search the circle contour by active contour model in the sequence images.Then，LBP algorithm is utilized on the calibrate sequence images so as to get the circle contours more accurately.Finally，according to the roundness of the contours and circle areas in the statistics list，DOF of optical microscope is effective calibrated.Experimental results demonstrate that the proposed method can be used to measure the DOF on optical microscope，which is of great significance for the follow-up image processing.

Depth-of-Field；active contour model；LBP；roundness；Circle of Confusion

TP391.4

A

1003－3114（2015）06－79－5

10.3969／j.issn.1003－3114.2015.06.21

崔 力，李長陽.基于彌散圓的光學顯微鏡景深自動標定方法［J］.無線電通信技術，2015，41（6）：79－83.

2015－07－15

崔 力（1989―），男，碩士研究生，主要研究方向：顯微圖像處理測量技術。李長陽（1990―），女，碩士研究生。主要研究方向：顯微圖像處理測量技術。