抗綠膿桿菌活性物質的篩選及有效成分研究

翟俊偉 劉曉榮

·論著·

抗綠膿桿菌活性物質的篩選及有效成分研究

翟俊偉 劉曉榮

目的從眾多微生物中找到能夠對抗綠膿桿菌的活性物質，分析其成分并分離鑒定，找到更有效的抗綠膿桿菌，為臨床醫學研究提供幫助。方法選取唐山市豐南區醫院花園土進行細菌培養，通過各項研究篩選微生物，并對抗綠膿桿菌的活性成分表達條件不斷優化，研究不同環境下酸堿值、培養基、時間以及溫度條件下比較其活性成分，從而得出適合的發酵條件。收集發酵液，采用離子交換、硫酸銨沉淀、分子篩等方式將蛋白純化。測定抗綠膿桿菌活性成分的敏感性、穩定性、分子量等。結果從研究的土壤中篩選出了5種菌群，經過革蘭氏染色、菌落形態、RDP序列分析等操作，分析了菌株的不動細菌數以及假單胞菌屬。結論拮抗綠膿桿菌的活性成分分析研究顯示，活性成分不適宜在高溫下存活，且容易被蛋白酶K水解，分子量大約在35 kD左右，屬于抗菌蛋白。

綠膿桿菌;活性物質;表達條件;菌落形態，發酵

綠膿桿菌能產生多種致病物質，主要是內毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白組胞素等。其致病特點是引起繼發感染，多發生在機體抵抗力降低時，如大面積燒傷，長期使用免疫抑制劑等。臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥等［1，2］。應用抗綠膿桿菌免疫力血清可降低患者繼發敗血癥的發生率和病死率［3］。因此研究對綠膿桿菌的抗體并分析其成分具有較高臨床意義。本次研究基于這一背景，采用實驗檢驗方式，從最初的試劑、設備準備開始，針對抗綠膿桿菌活性物質展開篩選并研究其成分，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑本次研究由于研究重點在于綠膿桿菌方面，因此應注意實驗準備工作以及相關藥劑的設定，具體而言，可分為培養基的準備、實驗菌種的培養、土壤樣品的選取、主要實驗試劑的準備以及實驗需要儀器的安排等，具體如下:

1.1.1 培養基的準備［4-6］:培養基主要有發酵培養基與LB培養基兩種。發酵培養基的制備包含1 000 ml蒸餾水、5 g氯化鈉、3 g葡萄糖、5 g胰蛋白胨以及3 g酵母膏，將發酵培養基的酸堿值控制在7.2～7.4，制備完成后將培養基放在121℃的高溫環境中半小時來高壓、高溫滅菌。LB培養基的制備包含1 000 ml蒸餾水、10 g氯化鈉、5 g酵母膏以及10 g胰蛋白胨，同樣將制備好的培養基酸堿值調節到7.2～7.4，放在121℃的高壓、高溫環境中滅菌0.5 h。除上述兩種培養基外，還應制備復篩培養基以及固體培養基。復篩培養基的制備主要是在蒸餾水中加入濃度為5%的氯化鈉溶液、2.5%的酵母膏以及5%的胰蛋白胨。固體培養基的制備方面，主要為抑菌作用并讓其處于相對黏稠狀態，因此在制備上需加入一定量的瓊脂，具體而言，需在蒸餾水中加入濃度為2.5%的氯化鈉溶液，1.3%的酵母膏以及2.5%的胰蛋白胨，同時將1%瓊脂加入其中。上述兩種培養基均將酸堿值調整至7.2～7.4，并放置在高溫高壓(121℃)環境中0.5 h，將制備中可能產生的細菌消滅。

1.1.2 實驗菌種的培養:本次研究中實驗菌種主要有兩種，即指示菌以及供試菌。指示菌為PA01，由醫院本身研究提供。供試菌為B2002、B2001、B1506、B1505、B1503.

1.1.3 土壤樣品的選取:研究中使用的土壤為正常土壤，主要取自我院花壇中土壤。取樣之后將土壤按照重量分類(保障土壤成分均勻，并且取自同一范圍)，有效編號。

1.1.4 主要實驗試劑的準備:實驗試劑包含兩性電解質、寬分子量蛋白以及試劑盒。其中試劑盒為上海華舜公司(生物技術)生產，用于抽提注釋小量細菌的DNA基因組。

1.1.5 實驗需要儀器的安排:對綠膿桿菌的研究需要的儀器較多，涉及到滅菌、觀察、培養等各項操作，因此在儀器準備方面如下:上海尤尼柯公司生產的紫外可見分光光度計、上海申安醫療公司生產的滅菌鍋、北京六一儀器公司生產的電泳儀、常規顯微鏡、冷凍離心機、常州國華公司生產的恒溫培養振蕩器、上海精宏實驗公司生產的生化培養箱以及蘇州泰安空氣技術公司生產的潔凈工作臺。上述儀器為本次研究時使用到的主要儀器。

1.2 方法綠膿桿菌實驗涉及到其耐藥性研究以及外膜通透性研究，因此在試驗方法上首先應進行綠膿桿菌的篩選與培養，其次將其菌株進行分離研究，之后鑒定其菌株狀態，便可開始對其活性成分的條件表達、成分純化以及成分特征展開研究。

1.2.1 拮抗綠膿桿菌的篩選與培養:之前提到，土壤的選取是在我院花壇中選取，在土壤采集之后，需要將其放在4℃的環境中妥善保存，以免影響到培養效果。在拮抗綠膿桿菌的篩選方面，本次研究采用的是“雙層平板法”。首先制作下層部分，將出篩培養基與指示菌(研究中的指示菌為綠膿桿菌)混合均勻，使之成為下層培養基。上層部分的制作方面，首先應將已經妥善保存的土壤研磨充分，之后實施梯度稀釋，取土壤懸液1 ml倒入之前已經做好的下層培養基上。制作完成后，需將營養瓊脂培養基倒入(需注意此培養基倒入時的溫度需保持在50℃)，在充分混合后上層培養基制作完成。整體的培養基需要放置在保持37℃的環境中，同時做好日觀察記錄［7，8］。

1.2.2 拮抗綠膿桿菌的菌株分離:當制備好的培養基上已經產生菌落時，可用牙簽(經過滅菌處理)將初篩雙層平板上已經出現的透明圈菌落挑起部分，實施劃線分離操作。將單一菌落挑取出來，用點接方式將其放在驗證版(含有綠膿桿菌)上面，并在37℃環境中靜置培養3 d。3 d后觀察驗證版上是否已經出現了透明圈，若出現則注意觀察產圈是否呈穩定狀態。對于呈穩定性的產圈，其菌株應進一步展開純化操作并妥善保存，以備后續試驗研究。

1.2.2.1 抑菌活性測試［9，10］:①首先在直徑為100 mm的指示平板上將抑菌平板固體培養基(溫度為50℃，劑量為50 ml)加入，靜置存放直至其完全冷卻。冷卻之后將綠膿桿菌菌懸液(劑量為100 μl，濃度為OD600=0.2)均勻的涂抹在培養基上。②之后進行抑菌活性測定，本次研究采用的是打孔擴散法。使用打孔器將指示平板上打孔，孔直徑約在9 mm左右。通過已經打好的孔注入發酵上清液約300 μl，在37℃的恒溫下培育24 h。之后觀察打孔周邊抑菌圈狀態，主要觀察其大小，將透明圈的直徑測量并記錄。

1.2.2.2 菌株的重復篩選:首先應將適合的菌株實施發酵，選取通過分離找出的帶有拮抗綠膿桿菌能力的菌株，將其采用搖瓶方式發酵。使用之前制備好的復篩培養基，將其接種于錐形瓶中(錐形瓶中裝液量控制在100 ml/250 ml)，接種量在0.01，將其放在37℃環境中，使用250 r/min搖振培養。實驗過程中，每隔12 h需觀察發酵液狀態，8 000 r/min搖振離心10 min，將菌體去除。抑菌活性的測定采用打孔擴散法，觀察菌體狀態以及透明圈直徑并嚴格記錄。菌株篩選方面，選取對綠膿桿菌存在抑菌作用的且抑菌圈相對較大的菌株。③之后排出發酵液中其他影響，主要為酸堿作用影響。在培養24 h之后，測定發酵液的酸堿值，并對比實驗研究前發酵液的酸堿值。實驗前酸堿值已經在培養基制備時保持在了7.2～7.4，因此若產生變化便可得出在發酵過程中菌株是否會產生有機酸或是有機減。④最后實施蛋白酶的處理。將蛋白酶K配置成為溶液狀態，比例為每毫升含5 mg。在ep管中放入0.1 ml蛋白酶K溶液，同時將0.4 ml發酵液放入其中，讓其最終濃度保持在1 mg/ml。將溶液酸堿值調節到7.0左右。與此同時，需要在0.4 ml發酵液中加入0.1 ml的雙蒸水，以此作為對照研究。將2組處理放在37℃環境中0.5 h，觀察發酵上清液在抑菌活性上的變化，并將抑菌圈出現縮小趨勢的菌株篩選出來備用。

1.2.3 菌株的鑒定:首先對拮抗綠膿桿菌實施形態學鑒定。選取已經培養了24 h以上的菌株，采用革蘭氏染色法，利用顯微鏡觀察菌體狀態，包含形狀以及顏色等基本方面。將選取的菌株劃線培養(在營養瓊脂平板上面)，之后觀察菌落變化情況。DNA染色體的提取:首先選取1 ml細菌培養液，采用12 000 r/min離心1 min，之后盡可能將上清部分吸盡，以免影響到研究準確性。想襯墊的細菌中加進溶液A 200 μl，充分振蕩，讓菌體保持在充分懸浮狀態，將每毫升200 μl的RNaseA選取200 μl加入，保持在37℃的環境中靜置30 min。將每毫升10 mg的蛋白酶K 20 μl加入到管中，充分混合之后靜置在55℃環境中1 h，期間應將試管顛倒數次保障樣品消化完全，也就是液體變得黏稠、清亮。將溶液B加入試管中200 μl，充分混合之后至溶液清亮。在管中加入無水乙醇200 μl，混合均勻之后觀察試管，此時可能存在絮狀物的沉淀，屬于正常現象，不會影響DNA提取，處理上可將沉淀物與溶液均加入吸附柱，靜置2 min。選取12 000 r/min離心1 min，加入漂洗液500～700 μl，將廢棄液丟掉之后將吸附柱放入收集管。

2 結果

2.1 拮抗綠膿桿菌分離菌形態研究根據本次研究結果不難發現，不同菌株在特征上不盡相同，本次研究共研究了5種菌株，大部分為短桿菌，只有編號為B1506的菌株為桿菌。菌體直徑方面，B1506的菌株直徑最小，B2002菌體直徑最大。見表1。

2.2 RDP研究本次研究測定了5種菌株的同源性、相似度最高菌株以及RDB分析，結果顯示，B1506菌株同源性達到了100%，其余4種同源性為99%。且B1506與B1505為不動桿菌屬，其余3項為假單胞菌屬。見表2。

表1 菌體形態研究表

表2 RDP測定結果表

3 討論

綠膿桿菌能產生多種與毒力有關的物質，如內毒素、外毒素a、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等，其中以外毒素a最為重要。外毒素a機制與白喉毒素有些類似，即最終使核糖體上延長因子2(ef～2)失活，抑制宿主細胞的蛋白質合成，但具體過程不同。此外，外毒素a和白喉毒素在蛋白質結構、免疫原性、鞭細胞和敏感動物等方面均有差異［11］。

3.1 活性物質篩選通過本次研究，了解到抗綠膿桿菌在活性物質篩選方面，土壤是微生物發育、成長的必須環境，此處微生物種類繁多，且較為集中，數量也比較大，因此土壤可以說是具有豐富菌種的微生物資源庫，對于拮抗綠膿桿菌的篩選可能性較大。研究選擇的瓊脂擴散法操作上較為簡單，將抑菌物質涂抹在指示板上，經過時間以及溫度影響讓其擴散后會形成抑菌區域，此區域濃度較穩定，對微生物生長起到抑制作用并呈現出透明狀，抑菌圈的大小能夠起到判斷抑菌物質效果、強弱的作用。研究發現，在確定發酵成分為抗菌蛋白或是抗菌肽之前，應將發酵液中的堿成分以及酸成分排除，減少其對綠膿桿菌的影響。對酸堿值的測定加上蛋白酶處理能夠確定最后分離物質是蛋白類還是肽類。

3.2 鑒定菌種本次研究由于條件限制，在DNA雜交試驗方面存在限制條件，因此是結合了序列分析來研究菌株形態的。鑒定結果顯示，B1506與B1505為不動桿菌屬，其余三項均屬于假單胞桿菌。其中由于B1505的細胞壁相對于其他幾種而言較厚，因此采用常規方式破壁并不能有有效將其細胞壁破壞，因此在基因組的提取方面難度相對較大，研究采用的是溶菌酶處理方式，在36 h之后將其溶解。由此可見，這類型細胞壁組織具有與其他4種不同的特殊性。且后續研究發現，其同源性達到了99%，很可能成為一種新的菌株。

3.3 發酵條件研究中使用的培養基初始酸堿值在7.2～7.4，這對抗菌肽的影響比較大，菌株不同，其成長需要的酸堿環境也不盡相同。本實驗中培養基起始pH值對抗菌肽的也很大，在初始酸堿為7.0～8.0時，B1505發酵液的抑菌活性較高，而其他酸堿值下抑菌活性明顯降低，說明培養基的初始酸堿值在發酵過程中對抗菌肽的產生具有重要作用。剛從普通土壤中分離得到的B1505發酵產量相對偏低，菌種生長較為緩慢，原因方面:(1)可能是自然條件下(普通土壤)相關基因表達量低，(2)培養條件也是影響發酵的重要因素。為了提高發酵產物的產量，我們對其進行了發酵條件優化試驗。培養基是進行發酵優化的重要方面，不同的微生物生長及發酵過程需要的培養基不同，且培養基對發酵產物的影響是至關重要的。由于采用小試搖瓶培養，重要目的是發現并純化發酵產物，所以產量相對較高足以進行后續實驗為標準［12］。

綜上所述，本次研究中針對5種菌株展開研究，經過革蘭氏染色、DNA提取等操作研究了菌落形態等，將其分為了不動桿菌屬以及假單胞菌屬。研究表明，抗綠膿桿菌的活性成分不易存放在高溫環境中，易被蛋白酶K水解，是一種抗菌蛋白。

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R 378.91

A

1002-7386(2015)02-0206-03

2014-10-22)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．015

063300河北省唐山市豐南區醫院檢驗科