轉化生長因子在銀屑病皮損組織中的表達研究

柏 楊，李江濤，王 琳(.宜賓市第一人民醫院風濕免疫科，四川 宜賓 644000；2.成都醫學院第一附屬醫院血液風濕科，四川 成都 60050；.華西醫院皮膚科，四川 成都 60000)

轉化生長因子在銀屑病皮損組織中的表達研究

柏 楊1，2，李江濤1，王 琳3
(1.宜賓市第一人民醫院風濕免疫科，四川 宜賓 644000；2.成都醫學院第一附屬醫院血液風濕科，四川 成都 610050；3.華西醫院皮膚科，四川 成都 610000)

目的 探討轉化生長因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)在銀屑病發病機制中的作用，為銀屑病的治療提供一定的理論基礎。方法 應用免疫組織化學SP法測定58例銀屑病皮損組織(19例尋常型銀屑病、20例膿胞型銀屑病、19例紅皮病型銀屑病)皮損組織和10例正常皮膚組織TGF-β1的表達量，并進行比較分析。結果 定位表達顯示：在正常皮膚組織中TGF-β1主要在表皮基底細胞中表達，表皮棘層及真皮中通常無表達或低表達；銀屑病皮損組織中TGF-β1在真皮乳頭層有明顯表達，表皮(包括基底層)中無表達或低表達。定量測定顯示，銀屑病皮損組織中IOD/area較正常皮損組織高，差異有統計學意義(P< 0.05)；3種銀屑病皮損組織間TGF-β1表達差異無統計學意義(P> 0.05)。結論 TGF-β1表達異常可能在銀屑病發病機制中有重要作用。

轉化生長因子-β1；銀屑病；免疫組織化學；細胞因子

銀屑病是一種免疫介導的慢性、炎癥性疾病，主要臨床表現為皮膚出現鱗屑性紅斑或斑塊，還可伴有關節、心血管等其它系統損害。病情易反復，給患者生活帶來巨大困擾，明顯降低患者生活質量。銀屑病的發生與發展受遺傳和環境因素雙重影響，發病機制目前還不完全清楚，已經發現有多種細胞因子與之相關[1]，包括表皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL-6、IL-23)等。本研究采用免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)方法(SP法)檢測58例銀屑病患者皮損組織中TGF-β1表達，探討TGF-β1在銀屑病中的作用并為臨床治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 銀屑病皮損組織來源于2006～2013年在四川大學華西醫院和宜賓市第一人民醫院58例確診為銀屑病患者，包括19例尋常型銀屑病、20例膿胞型銀屑病、19例紅皮病型銀屑病皮損組織。患者納入標準：均有典型或較為典型的皮損，并經病理檢查證實符合銀屑病的組織病理改變，近3個月內未服用過糖皮質激素及免疫抑制劑，停止其他系統治療和光療法至少1個月，近3周內皮損未進行過局部治療，不伴有可能影像研究結果的重要疾病。正常皮膚組織10例均為我院骨科手術時修剪的殘余的四肢新鮮正常皮膚組織，包括表皮、真皮和皮下組織，大小為0.5 cm× 1.0 cm，局部無感染、出血、潰瘍、腫瘤等，且為不易經常被摩擦處。正常皮膚組與銀屑病各亞組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P< 0.05)，具有可比性，見表1。

表1 各組一般資料情況

1.2 實驗方法 所有標本均經10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制成蠟塊備用。實驗均采用免疫組織化學鏈酶親和素-生物素法(SP法) 檢測TGF-β1在皮膚組織的表達。實驗步驟：①常規脫蠟、水化；② 3%H202阻斷內源性過氧化物酶；室溫孵育10 min，PBS洗 5 min×2次；③高溫隔熱水浴抗原修復；④封閉細胞Fc受體：封閉用羊血清(北京中杉金橋)封閉切片，置室溫下孵育15 min，傾去多余血清(不洗)；⑤滴加一抗(1∶150小鼠抗人IgG型TGF-β1單克隆抗體—圣克魯斯生物公司)，4 ℃過夜孵育；⑥室溫下復溫20 min，PBS液洗5 min×3次；⑦ 滴加二抗：滴加生物素標記的IgG型山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋)，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×2次；⑧ 滴加三抗：滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋)，37 ℃孵育30 min，PBS液洗5 min×2次；⑨DAB顯色：滴加DAB液(武漢博士德)鏡下觀察適時終止(顯色時間約3 min左右)；⑩常規蘇木素復染、2%鹽酸酒精分化、返藍、脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對照為正常皮膚組織，空白對照用PBS代替一抗。免疫組化陽性細胞定量方法：所有組織切片均由兩位有經驗的病理醫師在普通光鏡下雙盲法讀片，觀察判斷細胞因子TGF-β1在銀屑病皮損和正常皮膚切片組織上的表達定位。采用OLYMPUS BX51顯微鏡，DP Manager圖像采集軟件和Image-proplus 6圖象分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片5個視野(10×40倍)測定陽性細胞的累及光密度 (IOD值)及面積(area)，以IOD/area值表示TGF-β1相對含量，其值越大表示抗原含量越高。

1.3 統計學方法 使用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。資料服從正態分布時，采用t檢驗或方差分析；資料不服從正態分布時采用t’檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1在皮膚組織中的定位表達 在正常皮膚組織中，TGF-β1主要在表皮基底細胞中表達，在表皮棘層細胞及真皮中通常無表達或低表達；在銀屑病組皮損組織中，可見表皮層明顯增厚，真皮毛細血管增生，在增厚的表皮細胞中TGF-β1通常仍是無表達或低表達，其中在基底層細胞中的表達與正常皮膚組織相比明顯下調，但在真皮乳頭層有明顯表達；在空白對照組中TGF-β1在表皮、真皮區均無表達，見圖1。

圖1 TGF-β1(1：150)在皮膚組織中的表達(SP，×400) a：尋常型銀屑病組；b：紅皮型銀屑病組；c：膿胞型銀屑病組；d：正常皮膚組；e：空白對照組

2.2 TGF-β1在皮膚組織中的定量表達 銀屑病組TGF-β1表達量高于正常皮膚組，紅皮型銀屑病組、尋常型銀屑病組及總銀屑病組的平均光密度均值高于正常對照組，差異有統計學意義(P< 0.05)，膿胞型銀屑病組與正常對照組之間、三亞組間兩兩比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 TGF-β1在各組皮膚組織中的表達

a：紅皮型亞組與尋常型亞組比較；b：紅皮型亞組與膿胞型亞組比較；c：尋常型亞組與膿胞型亞組比較

3 討論

TGF-β家族是一類廣泛存在于多個組織，具有多種調節功能的細胞因子，參與細胞增殖、分化、遷移、凋零、炎癥反應、血管增生等多種細胞活動。TGF-β分為三個亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，它們功能相似，其中TGF-β1為主要存在形式[2]，活性也最強。TGF-β1/Smads信號通路為其主要信號傳導方式，TGF-β1首先與TGF-βR結合，激活細胞內Smad2-3磷酸化，被活化的Smad2-3與Smad4形成復合體，然后進入到細胞核，參與調節靶基因轉錄。TGF-β1/Smads信號通路中，Smad2-3作為TGF-β1的下游細胞因子，Smad4則是Smad2-3進入細胞核的橋梁，而Smad6-7則發揮負向調節功能[3]，這被稱為典型通路。近年來也有文獻報道，除經典通路外還存在MAP激酶途徑等多種非典型信號通路[4]。TGF-β1在體內分布廣泛，能通過自分泌、旁分泌及內分泌形式到達靶組織[5，6]，發揮生物學效應。

關于銀屑病的發病機制，目前認為IL-23/Th17通路在其中起著至關重要的作用，IL-23能調節表皮增生、棘層增厚、過度不全角化及正型角化過度；Th17細胞自原始T細胞分化而來，能依次產生前炎癥細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22及IL-26，刺激角質細胞使其異常增生，并進一步產生前炎癥細胞因子、趨化因子、抗菌肽，刺激炎癥區的其它免疫細胞，促使炎癥進一步發展，除參與炎癥反應，Th17細胞也在血管生成過程中扮演重要角色；IL-23是Th17細胞的上游刺激物，有促進Th17細胞的發育及維持其功能的作用。TGF-β1是IL23/Th17軸中重要的介質，其作用是促進IL-23受體表達，以及促進Th17細胞的分化[7，8]。同時作為炎癥介質參與炎癥細胞浸潤，TGF-β1作為一種重要的炎癥介質，根據所處環境不同，有促進炎癥和抑制炎癥雙重的作用[9]。銀屑病主要病理表現為表皮增生、血管擴張及增殖及炎癥細胞浸潤，TGF-β1在上述病理變化中都能起到調節作用[10，11]。

本實驗中，TGF-β1在銀屑病表皮基底層細胞中表達明顯下降。表皮基底層細胞具有較強的增殖能力，增殖的細胞可進一步發生分化，然后補充凋亡的表皮細胞并調控表皮層厚度。這提示TGF-β1具有抑制基底細胞增殖的作用，此結論與細胞體外培養實驗的結果相符，體外細胞培養發現TGF-β1抑制表皮細胞增殖[12]。但在動物實驗中，通過轉基因技術得到一種TGF-β1在表皮基底細胞中表達增強的小鼠模型，即角蛋白5-轉化生長因子-β1(K5-TGF-β1)轉基因小鼠，其皮損中同時觀察到TGF-β1表達增強及表皮增生，并伴有其它一些類似銀屑病的病理表現[12]，此現象與TGF-β1抑制細胞增殖的功能相矛盾。這可能是皮損處炎癥反應中的其它因子(如TNF-α、IL-17、IL-22等)發揮了促進表皮細胞增殖的作用，并且其強度超過了TGF-β1對表皮增殖的抑制作用，導致雖然表皮中TGF-β1表達增強，但病理上仍表現為表皮增生。用腫瘤壞死因子拮抗劑治療K5-TGF-β1轉基因小鼠，當炎癥控制后，表皮增殖減輕[2]，一定程度上支持了上述推測。另外，本實驗還觀察到，通常情況下，TGF-β1由表皮基底層細胞分泌，真皮乳頭層不分泌或極少分泌，故考慮：銀屑病皮損處真皮乳頭層中TGF-β1表達增強可能是由于在某些因素刺激下表皮基底層細胞中的TGF-β1大量通過旁分泌形式進入導致。由于基底細胞中TGF-β1大量外流，引起TGF-β1代償性分泌增強，故皮損中總TGF-β1表達量是上調。而進入真皮乳頭層的TGF-β1則成為一種炎癥介質，參與炎癥反應，促進皮損區炎癥細胞的浸潤。若此假設得到進一步實驗的證實，則能為藥物開發提供另一種思路，即開發一種能抑制TGF-β1從基底層細胞進入周圍組織并有一定的抗炎作用的藥物，或許能在銀屑病的治療上取得比TGF-β1拮抗劑更好的療效。故進一步深入研究TGF-β1在銀屑病發病機制中的作用對治療銀屑病有重要指導意義。銀屑病依臨床表現可分為尋常型、紅皮型、膿胞型和關節型，關節型伴有關節病變，皮膚表現與其它類型銀屑病相同。尋常型銀屑病的病理表現為角化過度伴角化不全，角化不全區可見munro微膿腫，顆粒層明顯減少或消失，棘層增厚、表皮突整齊向下延伸，乳頭層上方棘層變薄，毛細血管擴張并迂曲，周圍可見淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，紅皮型和膿胞型的病理表現與尋常型基本相同，其中紅皮型真皮淺層血管充血擴張更明顯，膿胞型可見kogoj微膿腫。此實驗中銀屑病各亞型間TGF-β1表達無統計學差異，提示TGF-β1表達量銀屑病類型無關，不能證明TGF-β1能調控銀屑病真皮淺層毛線血管擴張程度與kogoj微膿腫形成。膿胞型銀屑病組TGF-β1表達較正常組增強，但無統計學意義，可能與標本量較小有關。以后可進一步擴大樣本量，并在此基礎上依據銀屑病皮損的嚴重程度再進行分組，了解與銀屑病嚴重程度之間的關聯性。另外，銀屑病的發病是多種細胞因子共同參與調控的結果，所以單個細胞因子的轉基因小鼠模型(如K5-TGF-β1、K5-STAT3、K14-AREG等)都有類似銀屑病的皮膚表現，但都不能達到很令人滿意的程度[14]，進一步弄清TGF-β1與其它細胞因子協同作用機制，才能對銀屑病有更全面的認識，對提高銀屑病的診治水平有一定的幫助。

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Expression of TGF-β1in psoriatic skin tissue

BAIYang1，2，LIJiang-tao1，WANGLin3
(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology，TheFirstPeople’sHospitalofYibin，Yibin644000，China；2.NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China；3.DepartmentofDermatology，WestChinaHospital，Chengdu610000，China)

LIJiang-tao

Objective To investigate the role of TGF-β1in pathogenesis of psoriasis in order to provide a theoretical basis for the treatment of the disease.Methods By immunohistochemistry (IHC) SP assay，TGF-β1expression was determined in skin tissues obtained from patients with psoriasis vulgaris (n= 19)，pustular psoriasis (n= 20) and erythrodermic psoriasis(n= 19)，as well as normal skin tissues (n= 10)，and compared among the groups.Results In normal skin tissue，the expression of TGF-β1was located in the basal layer of epidermis，and the expression was weak or absent in the stratum spinosum of epidermis and the papillary layer of dermis.In psoriatic lesions，the expression of TGF-β1was located in the papillary layer of dermis but the expression was weak or absent expression in the epidermis.Quantitative analysis revealed that IOD/area was significantly higher in the psoriasis groups than that in normal group (P< 0.05).However，no significant difference among the three sub-types of psoriasis was detected (P> 0.05).Conclusion The abnormal expression of TGF-β1may play an important role in pathogenesis of psoriasis.

TGF-β1；Psoriasis；Immunohistochemistry；Cytokine

四川省衛計委科研基金資助項目(編號：110599)；宜賓市科技局科研基金資助項目(編號：2012SF004)

李江濤

R758.63

A

1672-6170(2015)06-0040-04

2015-04-09；

2015-08-28)